乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細胞繁殖與毒性定量檢測試劑是一種旨在通過酶聯連續反應系統檢測由于細胞損傷導致的細胞內穩定的乳酸脫氫酶釋放到細胞外，使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑（INT）還原為紅色甲臜（farmazan），即比色法定量測定酶活性，以評價活體細胞繁殖的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種藥物、化學、環境因子和營養因子處理的貼壁或懸浮生長中的動物或人體細胞。替代傳統的同位素[⁵¹ Cr]釋放檢測的佳選擇。產品嚴格無菌，即到即用，簡捷敏感，性能穩定，顯色清晰，檢測準確，重復性好。

技術背景

細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的損害或*裂解導致細胞漿內的酶釋放外泄到培養液里，其中包括活性穩定的乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）釋放法的測定是基于在乳酸脫氫酶的作用下，還原NAD⁺反應生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應生成紅色生色產物甲臜（formazan），在490nm波長下產生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標志：吸光值與細胞死亡或毒性程度成線性正相關。酶聯連續反應系統為：

產品內容

裂解液（Reagent A）      毫升

補充液（Reagent B） 毫升

反應液（Reagent C）      毫升

顯色液（Reagent D）      毫升

終止液（Reagent E）      毫升

標準液（Reagent F）     微升（另購）

產品說明書                         1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，反應液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

96孔細胞培養板：用于細胞操作的容器

細胞培養箱：用于孵育反應

孔板離心機：用于沉淀細胞

酶標儀：用于定量檢測染色后的細胞

實驗步驟

• 貼壁細胞檢測

• 準備96孔細胞培養板的待測細胞（每孔100微升）：包括未處理的對照細胞（樣品對照孔），未處理的后續裂解的細胞（樣品大酶活性對照孔），以及藥物處理的細胞（處理樣品孔），并做好標記（細胞密度為每孔2 X 10³至2 X 10⁴細胞）
• 到規定的檢測時間點前1小時，從濕潤的細胞培養箱里取出待測的96孔細胞培養板（注意：確保細胞培養液維持在100微升容量）
• 加入xx微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續裂解的細胞孔里（樣品大酶活性對照孔）
• 同時加入xx微升補充液（Reagent B）到其余所有檢測孔里
• 放回濕潤的細胞培養箱里，繼續培養1小時，即規定檢測時間
• 從濕潤的細胞培養箱里取出待測的96孔細胞培養板
• 放進孔板離心機離心10分鐘，速度為250g
• 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應孔里，避免觸摸細胞顆粒，同時注意做好標記
• 分別加入xx微升反應液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）
• 分別加入xx微升顯色液（Reagent D） 
• 搖動96孔板混勻
• 在室溫下孵育30分鐘，避免光照
• （選擇步驟）分別加入xx微升終止液（Reagent E）
• 即刻放進酶標儀里測讀：波長490nm
• 計算處理樣品實際吸光讀數：處理樣品孔吸光讀數－樣品對照孔吸光讀數
• 計算樣品細胞大酶活性的實際吸光讀數：樣品大酶活性對照孔吸光讀數－樣品對照孔吸光讀數
• 計算細胞毒性或死亡率（％）：

（處理樣品實際吸光讀數÷樣品細胞大酶活性的實際吸光讀數）X 100

• 或繪制細胞生長曲線：縱座標（Y軸）為實際吸光讀數（A）；橫坐標（X軸）為細胞數或時間點或藥物濃度；據此計算其LD₅₀

• 懸浮細胞檢測

• 準備96孔細胞培養板的待測懸浮細胞（每孔100微升）：包括未處理的對照細胞（樣品對照孔），未處理的后續裂解的細胞（樣品大酶活性對照孔），以及藥物處理的細胞（處理樣品孔），并做好標記（細胞密度為每孔5 X 10³至5 X 10⁴細胞）

• 到規定的檢測時間點前1小時，從濕潤的細胞培養箱里取出待測的96孔細胞培養板（注意：確保細胞培養液維持在100微升容量）
• 加入xx微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續裂解的細胞孔里（樣品大酶活性對照孔）
• 同時加入xx微升補充液（Reagent B）到其余所有檢測孔里
• 放回濕潤的細胞培養箱里，繼續培養1小時，即規定檢測時間
• 從濕潤的細胞培養箱里取出待測的96孔細胞培養板
• 放進孔板離心機離心10分鐘，速度為250g
• 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應孔里，避免觸摸細胞顆粒，同時注意做好標記
• 分別加入xx微升反應液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）
• 分別加入xx微升顯色液（Reagent D） 
• 搖動96孔板混勻
• 在30℃溫度下孵育30分鐘，避免光照
• （選擇步驟）分別加入xx微升終止液（Reagent E）
• 即刻放進酶標儀里測讀：波長490nm
• 計算處理樣品實際吸光讀數：處理樣品孔吸光讀數－樣品對照孔吸光讀數
• 計算樣品細胞大酶活性的實際吸光讀數：樣品大酶活性對照孔吸光讀數－樣品對照孔吸光讀數）
• 計算細胞毒性或死亡率（％）：

（處理樣品實際吸光讀數÷樣品細胞大酶活性的實際吸光讀數）X 100

• 或繪制細胞生長曲線：縱座標（Y軸）為實際吸光讀數（A）；橫坐標（X軸）為細胞數或時間點或藥物濃度；據此計算其LD₅₀

注意事項

• 本產品為100次（1個96孔板）操作
• 操作時須戴手套
• 整個操作須無菌操作
• 建議每個樣品安排3個孔，即重復3次，計算時取其平均值
• 檢測體系相應增加，試劑用量按比例相應增加：例如200微升檢測體系，試劑用量增加1倍
• 每孔中的培養液需100微升，避免使用周邊培養孔（常常液體蒸發而減少）
• 系統測試，可以加入10微升標準液（Reagent G）到50微升無細胞的細胞培養液里，然后加入反應液和顯色液即可
• 細胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）處理
• 孵育時，須避光
• 染色完成后，建議即刻檢測，遲不得超過1小時
• 細胞培養和處理時，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否則影響檢測的準確性
• 血清含有乳酸脫氫酶，建議使用濃度不要超過1％
• 細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養箱內外溫差過大等因素會造成細胞自然釋放乳酸脫氫酶
• 酚紅會干擾檢測
• 樣品大酶活性對照孔或大OD吸光讀數與細胞裂解程度密切相關
• 如果用戶沒有孔板離心機，則移取上清液時格外小心
• 如果用戶沒有匹配的波長，可以使用波長470nm至570nm之間的任一波長替代
• 本公司提供系列細胞繁殖檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感