動物細胞/組織核糖體分離試劑盒產品說明書 主要用途 動物細胞/組織核糖體分離試劑是一種旨在通過物理破壁和化學破膜以及等密度超速離心處理方法，分離出完整而純化的80S核糖體組分的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮或凍存的動物和人體細胞或組織胞漿核糖體成分的分離。產品即到即用，操作簡易，性能穩定，無核酶和蛋白酶污染，萃取純度和產量皆高。 技術背景 核糖體（ribosome）是一種細小顆粒的核糖蛋白復合物（ribonucleoprotein complex），生命細胞制造蛋白質的非膜性結構元素和轉譯裝置（translational apparatus），由RNA和蛋白質組成，具有多肽轉移酶的活性。其分成2個亞體：大亞體和小亞體。核糖體通過大亞體結合轉運核糖體（tRNA），而小亞體結合信使RNA（mRNA），然后閱讀RNA提供的信息，轉譯（translation）成氨基酸，連接成蛋白分子。真核生物的核糖體位于胞漿（游離核糖體）、線粒體和葉綠體中。其中胞漿核糖體為80S核糖體，由40S小亞體和60S大亞體組成：60S由5S RNA、28S RNA、5.8S亞基和49個蛋白組成；而40S由18S RNA和33個蛋白組成。線粒體和葉綠體核糖體與原核生物相似，為70S核糖體，由30S小亞體和50S大亞體組成：50S包括5S、23S RNA和34個蛋白；30S包括16S RNA和21個蛋白。 產品內容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 分離液（Reagent C） 毫升 保存液（Reagent D） 毫升 產品說明書 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 HANK平衡鹽緩沖溶液（HL12028）或PBS緩沖溶液（HL12033）：用于清理細胞 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細胞脫離 *細胞培養液（HL12052）：用于中和胰蛋白酶的細胞培養基 50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器 臺式離心機：用于樣品操作 超速離心機：用于樣品操作 DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞 渦旋震蕩儀：用于混勻 實驗步驟 實驗開始前，將試劑盒里的試劑置于冰槽里凍融備用。然后進行下列操作。 一、細胞核糖體分離 1．準備5至10瓶75cm2細胞培養瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養表面 2．分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去 3．重復實驗步驟2一次 4．加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面 5．置入37℃培養箱3分種 6．輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落 7．分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養液 8．移入一個50毫升錐形離心管 9．放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g 10．小心抽去上清液 11．加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞 12．放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g 13．小心抽去上清液 14．加入預冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 15．渦旋震蕩5秒，充分混勻 16．即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器 17．置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：未見組織塊） 18．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管 19．放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g 20．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管 21．放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作 22．移取xx毫升分離液（Reagent C）到8毫升超速離心管 23．小心沿著管壁，在分離液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述獲得的后線粒體組分 （注意：避免晃動，同時離心前，使用礦物油填滿離心管） 24．小心放進4℃超速離心機離心2小時，速度為260000g 25．小心取出離心管 26．小心抽去上清液 27．加入xx毫升保存液（Reagent D），混勻顆粒群 28．轉移到到新的1.5毫升離心管 29．（選擇步驟）進行核糖體定量測定 30．放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里準備后續操作 二、組織核糖體分離 1．準備好新鮮或凍存的動物組織，并秤重以確定1至2克組織重量 2．（選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管 3．（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次 4．移入一個液氮凍存管 5．即刻放進液氮罐過夜 6．次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融） 7．放進一個預冷的15毫升錐形離心管 8．加入預冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 9．渦旋震蕩5秒，充分混勻 10．即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器 11．置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：未見組織塊） 12．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管 13．放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g 14．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管 15．放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作 16．移取xx毫升分離液（Reagent C）到8毫升超速離心管 17．小心沿著管壁，在分離液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述獲得的后線粒體組分 （注意：避免晃動，同時離心前，使用礦物油填滿離心管） 18．小心放進4℃超速離心機離心2小時，速度為260000g 19．小心取出離心管 20．小心抽去上清液 21．加入xx毫升保存液（Reagent D），混勻顆粒群 22．轉移到到新的1.5毫升離心管 23．（選擇步驟）進行核糖體定量測定 24．放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里準備后續操作 注意事項 1．本產品為10次操作（1克動物組織或5 X 107細胞/次） 2．建議使用足夠的組織或細胞量 3．樣品操作均須在4℃或以下狀態下進行 4．操作時，須無菌操作，避免污染母液 5．核糖體定量計算公式（微克/微升）： A260 11.1 6．如果進行核糖體蛋白萃取，建議使用純化核糖體蛋白質萃取試劑盒—HL16041 7．本公司提供系列核糖體分析技術產品 質量標準 1．本產品經鑒定性能穩定 2．本產品經鑒定分離的核糖體維持正常活性 3．本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶