細(xì)胞色素P450亞酶1A2活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

細(xì)胞色素 P450 亞酶 1A2 活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)中甲氧基異酚噁唑轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮后熒光峰值的變化，即采用熒光法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞或組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）或純化微粒體樣品細(xì)胞色素 P450 亞酶 1A2 的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素P450亞酶1A2，簡(jiǎn)稱為CYP1A2，是肝細(xì)胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一，也是芳香族碳?xì)浠衔锛恿u基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成員之一。在人體肝臟里占P450酶系15％。與

CYP1A1高度同源，特別是在外顯子2、4、5和6。CYP1A2由多個(gè)多態(tài)性變體，常見的是：1A和1F，與ka fei yin代謝和遲發(fā)性皮膚卟啉癥（porphyria cutanea tarda）相關(guān)。CYP1A2的作用在于體內(nèi)外源化合物（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化

作用（hydroxylation）,以及脂類合成包括膽固醇和類固醇。芳香族碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)CYP1A2的表達(dá)。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶（7－methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是細(xì)胞色素P450亞酶1A2的診斷標(biāo)記，其基于MROD選擇性催化細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑（7－methoxyresorufin）在甲氧基異酚噁唑脫甲基酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)530nm，

散發(fā)波長(zhǎng)590nm），來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞色素P450亞酶1A2的活性。甲氧基異酚噁唑脫甲基酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent C）和 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)比色皿或酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器

熒光分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為 37℃）：激發(fā)波長(zhǎng) 530nm，散發(fā)波長(zhǎng) 590nm，并置零

3． 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號(hào)管4． 加入 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到 1 號(hào)管5． 分別加入 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到 2 至 5 號(hào)管

6． 移取 xx 微升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 1 號(hào)管，混勻

7． 小心移取 xx 微升 1 號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 2 號(hào)管，混勻8． 小心移取 xx 微升 2 號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 3 號(hào)管，混勻9． 小心移取 xx 微升 3 號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到 4 號(hào)管，混勻10．將 1 至 5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

二、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

7． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)獲得相對(duì)熒光讀數(shù)

8． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 1 至 7 四次

9． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

三、 樣品測(cè)定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升待測(cè)樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

7． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相關(guān)熒光讀數(shù)

8． （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 1 至 7，測(cè)讀新的樣品

9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度

四、 計(jì)算樣品活性

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）]＝皮摩爾/

毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

五、 酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品2． 分別移取 xx 微升 緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中

3． 分別加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent B）

4． 分別加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

5． 分別加入 xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20 微克微粒體蛋白或 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）

（注意：樣品須清澈）6． 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板7． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

8． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)

9． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩

爾/升）

10．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度

11．活性計(jì)算：

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ xx（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]

＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 25 次（比色皿）或 85 次（酶標(biāo)板）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需 1 次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細(xì)胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒 30002.1）

5． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定

6． 如果酶活性過(guò)低，可以增加反應(yīng)時(shí)間至 30 分鐘

7． 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗*

8． 建議待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為 20 微克/100 微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為

100 至 200 微克/100 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 30030.1）

9． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

1. 通常人體細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素 P450 亞酶 1A2 活性濃度為：200－600 皮摩爾/分鐘/毫克蛋白

11．細(xì)胞色素 P450 亞酶 CYP1A2 單位活性定義為：在 37℃，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化 1 納摩爾

甲氧基異酚噁唑至羥基異吩噁唑酮所需的酶量作為一個(gè)活性單位

12．本公司提供系列毒理學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感