動物細胞/組織活性線粒體分離試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

動物細胞/組織活性線粒體分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出完整而純化的活性線粒體細胞器的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細胞的活性線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，可以被用于線粒體酶活性、細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品佳。

技術背景

線粒體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用：*，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃

冰箱里，有效保證 6 月

用戶自備

HANK 平衡鹽緩沖溶液（12028）或 PBS 緩沖溶液（12033）：用于清理細胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離*細胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的細胞培養(yǎng)基

15 毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50 毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗

1.5 毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分 DOUNCE 勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

一、動物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升凈化液（Reagent C）和 4 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

1． 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量（注意：實驗前使動物空腹 12 至 24 小時）

2． （選擇步驟）放進預冷的 50 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1    次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預冷的 xx 毫升裂解工作液

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放入預冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約 80 下）（注意：參見注意事項 8）

9． 將所有組織勻漿物移入 15 毫升錐形離心管，

10．放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g

11．小心移出上清液到另一個新的預冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

12．放進 4℃超速離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

13．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

14．（選擇步驟）加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

15．（選擇步驟）放進 4℃超速離心機再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

16．（選擇步驟）小心抽去上清液

17．加 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

18．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里

二、動物軟組織線粒體分離（化學處理法）

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

1． 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量（注意：實驗前使動物空腹 12 至 24 小時）

2． （選擇步驟）放進預冷的 50 毫升錐形離心管3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1 次4． 移入一個液氮凍存管

5． 即刻放進液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進一個 15 毫升錐形離心管

8． 加入預冷的 xx 毫升 裂解工作液

9． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

10．在冰槽里孵育 2 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒

11．加入預冷的 xx 微升 強化液（Reagent D）

12．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

13．在冰槽里孵育 5 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒（注意：參見注意事項 9）

14．加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E），用手混勻

15．放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g

16．小心移出上清液到另一個新的預冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

17．放進 4℃超速離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

18．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

19．（選擇步驟）加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

20．（選擇步驟）放進 4℃超速離心機再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

21．（選擇步驟）小心抽去上清液

22．加入 xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻

23．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里

三、動物細胞線粒體分離（細胞勻漿法）

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升活性液（Reagent F）、xx 毫升 凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

1． 準備 5 至 10 瓶 75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入 10 毫升用戶自備的 HANK 平衡鹽緩沖溶液或 PBS 緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)    瓶表面，

3． 小心抽去清洗液

4． 重復實驗步驟 2 至 3 一次

5． 加入 3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面

6． 放進 37℃培養(yǎng)箱孵育 3 分種

7． 手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落

8． 分別加入 10 毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液

9． 全部移入到一個 50 毫升錐形離心管

10．放進臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 200g

11．小心抽去上清液

12．加入 xx 毫升預冷的 清理液（Reagent A），混勻細胞

13．放進臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 300g

14．小心抽去上清液

15．加入預冷的 xx 毫升裂解工作液

16．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻細胞顆粒群

17．即刻放進預冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約 80 下）（注意：參見注意事項 8）

18．將所有細胞勻漿物移入 15 毫升錐形離心管

19．放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g

20．小心移出上清液到另一個新的預冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

21．放進 4℃超速離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

22．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

23．（選擇步驟）加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

24．（選擇步驟）放進 4℃超速離心機再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

25．（選擇步驟）小心抽去上清液

26．加入 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

27．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里

四、動物細胞線粒體分離（化學處理法）

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出 xx 微升 活性液（Reagent F）、xx 毫升 凈化液（Reagent C）和 xx 毫升的 裂解液（Reagent B）到 15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

1． 準備 5 至 10 瓶 75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入 10 毫升用戶自備的 HANK 平衡鹽溶液或 PBS 溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面

28．小心抽去清洗液

3． 重復實驗步驟 2 至 3 一次

4． 加入 3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面

5． 放進 37℃培養(yǎng)箱孵育 3 分種

6． 手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落

7． 分別加入 10 毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液

8． 全部移入到一個 50 毫升錐形離心管

9． 放進臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 200g

10．小心抽去上清液

11．加入 xx 毫升預冷的 清理液（Reagent A）

12．放進臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 300g

13．小心抽去上清液

14．加入預冷的 xx 毫升 裂解工作液

15．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

16．在冰槽里孵育 2 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒

17．加入預冷的 xx 微升 強化液（Reagent D）

18．渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

19．在冰槽里孵育 5 分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩 5 秒（注意：參見注意事項 9）

20．加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E），用手混勻

21．放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g

22．小心移出上清液到另一個新的預冷的 15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

23．放進 4℃超速離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

24．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

25．（選擇步驟）加入預冷的 xx 毫升 保存液（Reagent E）

26．（選擇步驟）放進 4℃超速離心機再次離心 5 分鐘，速度為 10000g

27．（選擇步驟）小心抽去上清液

28．加入 xx 毫升 保存液（Reagent E），充分混勻

29．即刻移入 1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里

注意事項

 1． 本產(chǎn)品為 10 次（1 克動物組織或 5 X 10⁷細胞）或 50 次（200 毫克動物組織或 1 X 10⁷細胞）     操作

 2． 實際操作的動物組織重量或細胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如 200 毫克動物組織：試劑用量是標

 準用量的五分之一

 3． 所有操作均須在 4℃或以下狀態(tài)進行

 4． 操作時，須戴手套

5． 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是 裂解液（Reagent B）和 保存液

（Reagent E）

6． 建議使用足夠的樣品量

7． 建議嚴格控制操作時間

8． 通常勻化次數(shù)為 80 下達到 80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶     可以通過顯微鏡觀察 3 微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于 50％可以增加     勻化次數(shù)

9． 通常孵育 5 分鐘達到 80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過    顯微鏡觀察 3 微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于 50％可以增加孵育時間和    渦旋震蕩次數(shù)

10．對于難以裂解的細胞，例如 HeLa 細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術處理

11．通常 5 X 10⁷細胞或 1 克動物組織的線粒體含量為 50 微克以上線粒體蛋白

12．如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

13．本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提

的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應減少

14．如果需要獲得99％以上純度的線粒體，使用 動物細胞/組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒－

10006.3

15．線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE 活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等

16．線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE 活性和熒光 JC 染色

17．本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等

18．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能長期穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正常活性

4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶