細胞內氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途
細胞內氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素
二乙酯，在細胞氧化條件下，產生熒光，來定量檢測細胞內活性氧族的生成和增加的而經典的技術方
法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的?？梢员挥糜诩毎蛲?、信號傳遞、衰老、代謝和
營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。
技術背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等
細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二
氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是
取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產品，一種*
自由通過細胞膜，并在細胞內長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧
化基、次氯酸等氧化，便產生熒光。據此測定細胞內活性氧族的濃度。
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀釋液（Reagent C） 毫升
保存液（Reagent D） 毫升
產品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細胞脫離
*細胞培養液（HL12052）：用于細胞操作所需的培養基
15 毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器
1.5 毫升離心管：用于細胞染色的容器
血細胞計數儀：用于細胞計數
臺式離心機：用于沉淀細胞
細胞流式儀：用于細胞熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡或：用于觀察熒光細胞
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熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析
實驗步驟
一、間接法
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）
放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀
釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
1． 準備1 瓶25cm2 細胞培養瓶的待測細胞
2． 小心抽去細胞培養液
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A）到細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面
4． 小心抽去清理液（Reagent A）
5． 加入1 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
6． 置入37℃培養箱1 分種
7． 振動培養瓶，使細胞脫落
8． 加入4 毫升用戶自備的*細胞培養液
9． 移入15 毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
10．移取10 微升在血細胞計數儀上進行細胞計數
11．移出1 X 106 細胞到新的15 毫升錐形離心管
12．放入臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
15．放進37℃恒溫水槽孵育20 分鐘，避免光照
16．放入臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
17．小心抽去上清液
18．加入預冷的xx 微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群
19．放進冰槽里
20．選擇下列方式之一進行操作：
a) 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm 氬離子激光，觀察50000 個細胞以上――
波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高
b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10 微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發波長490nm，散發波長530nm――
綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高
c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：
1）移取400 微升上述細胞懸液到1 毫升比色杯
2）加入xx 微升保存液（Reagent D）
3）上下傾倒混勻數次
4）放進熒光分光光度儀：激發波長490nm，散發波長530nm――
RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量高
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二、直接法
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）
放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀
釋液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。
1． 準備1 個細胞培養24 孔板的待測細胞，細胞鋪滿率達70％
（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm 培養皿，和其它培養孔板，見注意事項4）
2． 小心抽去細胞培養液
3． 小心沿著孔壁加入xx 微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液到1 個細胞
培養孔，覆蓋培養孔表面
4． 放進37℃細胞培養箱里孵育20 分鐘
5． 小心抽去含有染色工作液的細胞培養液
6． 小心沿著孔壁加入xx 微升37℃預熱的保存液（Reagent D）到細胞培養孔
7． 選擇下列方式之一進行操作：
注意事項
1． 本產品為20 次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 孵育時，必須避免光照
4． 本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm 培養皿，和各種培養孔板，須相應
調整操作用量：
操作容器操作用量
載玻片100 微升
載玻片培養皿1 毫升
35mm 培養皿1 毫升
96 孔培養板100 微升
48 孔培養板200 微升
24 孔培養板500 微升
12 孔培養板1 毫升
6 孔培養板2 毫升
25cm2 細胞培養瓶3 毫升
5． 根據細胞類型，調整染色工作液使用劑量（1：200 至1：1000 容量比），避免過度染色
6． 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞熒光分析
7． 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（HL12041），觀察細胞熒光增強現象
8． 本公司同時提供細胞內活性氧初級熒光測定試劑盒（HL10016.2），滿足不同用戶需求
9． 本公司提供系列活性氧分析試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰