人胚胎干細胞保存所需材料

  由軍事醫學科學院實驗動物中心提供清潔級孕13.5d ICR小鼠，用于制備小鼠成纖維細胞飼養層，處置符合動物倫理學標準的動物實驗的過程。人胚胎干細胞系PKU由北京大學第三醫院生殖中心建立并提供;kryo-550-16程序降溫儀為英國planner公司產品,由液氮壓力泵、液氮罐、層流冷凍箱、溫度傳感器組成。

人胚胎干細胞實驗方法

   人胚胎干細胞系接種在PKU小鼠胚胎成纖維細胞飼養層，Ⅳ型膠原酶消化和通道，分成人胚胎干細胞的三組冷凍保存。程序降溫法:用吸管將消化后人胚胎干細胞吹成若干團塊,取65個團塊移入配制的凍存液中,裝入麥管進行三段式降溫,即22℃~-7℃,每分鐘降溫2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃~-30℃,每分鐘降溫0.3℃→-30℃~-150℃,每分鐘降溫10℃。降至-150℃時置液氮中保存。

   改進的慢速冷凍法：一種包含人類胚胎干細胞培養及血清替代管，B管中的人類胚胎干細胞和二甲亞砜，顆粒60進入管道A，B和隨后的液體移管的培養液中，混合-70℃，前兩天搬進液氮。改進的慢速冷凍法：一種包含人類胚胎干細胞培養及血清替代管，B管中的人類胚胎干細胞和二甲亞砜，顆粒60進入管道A，B和隨后的液體移管的培養液中，混合-70℃，前兩天搬進液氮。傳統慢速凍存法:將60個團塊直接放入添加二甲亞砜的人胚胎干細胞培養基中混勻,分裝入凍存管,-4℃放置1h,-70℃第2天移入液氮長期保存。

人胚胎干細胞實驗后的評估

   融化后，將細胞保持完整和不分散從人胚胎干細胞聚集體回收的形態，回收率比較三組細胞，狀態復制的生長，分化的克隆程度。鑒定程序降溫組人胚胎干細胞的生物學特性。復蘇率:程序降溫組、改良慢速凍存組、傳統慢速凍存組的細胞復蘇率分別為78.5%、56.7%和23.3%,組間比較差異有顯著性意義（x2=6.81~13.89,P0.01）。

   生物學特性：第10代后解凍程序酷胚胎干細胞染色體核型正常，表面抗原鑒定人類胚胎干細胞特異性生物學特性的組：第10代后核型正常的解凍程序酷團的胚胎干細胞，人胚胎干細胞特異性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表達呈陽性,RT-PCR可檢測到nanog基因表達,SSEA-4及OCT-4陽性表達率分別為83.44%、89.38%。結論:①程序降溫法是冷凍保存人胚胎干細胞的有效方法,解凍后的干細胞在繼續培養過程中仍可保持其正常核型和生物學特性。②在不具備程序降溫儀的條件下,采用改良慢速凍存法保存胚胎干細胞也是可行的。