免疫熒光法測定抗原的基本原則以及注意事項 |
點擊次數:1865 更新時間:2013-08-29 |
采用直接免疫熒光法測定抗原 基本原則 熒光素標記在相應的抗體與相應的抗原,直接反應。簡單,特異性高的優點,非特異性熒光染色少。缺點是靈敏度低;每個檢查抗原要求熒光抗體的制備。免疫病理學檢查方法常用于細菌,病毒和其他快速檢查和活檢,皮膚活檢。 儀器和試劑 L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/,pH7.4 抗體溶液的熒光標記物:0.01mol/L PBS,pH7.4稀釋 l緩沖甘油:純無熒光甘油9 + pH9.2 0.2m碳酸鹽緩沖液1例分析。 l漆三桶(用0.01mol/PBS,pH7.4 1500ml) 我覆蓋的搪瓷盒(一層紗布墊鋪浸泡) 熒光顯微鏡 我滑架 L濾波器 我37℃溫箱等。 實驗程序 1滴0.01 mol/L PBS,pH7.4的檢測樣張,10min后試樣的丟棄,保持一定的濕度。 熒光標記的2抗體溶液加入適當稀釋,并*覆蓋件,覆蓋釉質瓷箱下,保溫時間(參考:30min)。 3拆下滑動,滑架,先用0.01mol/L,pH7.4 PBS沖洗,然后根據0.01mol/L秩序,pH7.4 PBS三缸浸泡3-5分鐘,每個氣缸,不時振蕩。 4刪除幻燈片,用濾紙吸去多余的水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,布滿了。 5立即用熒光顯微鏡。具體的觀察到的熒光強度,一般可用“+”的意思: (-)無熒光;熒光(±)可疑很弱;(+)熒光較弱,但清晰可見;(2+)熒光(+ + +——+ + + +)熒光閃閃發光。檢測到特異性熒光染色強度試件是“+”,以及各種控制顯示器(+)或(-),可以被看作是積極的。 注意事項 1對熒光標記的抗體稀釋,以確??贵w蛋白有一定的濃度,一般不應超過1:20稀釋,低濃度的熒光抗體,導致太弱,觀察。 2染色溫度和時間需要根據樣品和抗原不同而異,染色時間可以從10分鐘到30個小時,一般民有足夠的。染色采用室溫溫度(25℃),高于37℃可以提高染色效果,但不耐熱抗原(如日本腦炎病毒)可以用來在0-2℃溫度低,延長染色時間。低溫染色過液是37℃30分鐘效果好的多。 3為了保證熒光染色的正確性,*次測試設置下列控制,排除干擾的一些非特異性熒光染色。 (1)樣品的熒光控制:1-2 0.01 mol/L PBS pH7.4的標本。 (2)比控制(抑制):與特定的抗體未標記的樣本,再加上熒光標記的特異性抗體。 (3)陽性對照:已知的陽性標本用特異性熒光抗體。 如果樣品熒光控制和具體控制無熒光或熒光弱,積極控制和檢測的標本顯示很強的熒光,特異性陽性染色。 4一般標本比高壓汞燈下照射3min,熒光減弱,熒光在的觀察標本染色,隨著時間的延長,其熒光強度降低。 |
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