猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒使用說明書

目的：該試劑盒使用于檢測猴血清，血漿及相關液體樣本中狂犬病毒（RV）。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒實驗原理：該試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）測定標本中猴狂犬病毒（RV）。用純化的猴狂犬病毒（RV）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可以與樣品中狂犬病毒（RV）相結合，經過洗滌去除未結合的抗體和其他成分后再和HRP標記的狂犬病毒（RV）抗體想結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化為藍色，并在酸的作用下轉化為終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值進行對比，從而判定標本中猴狂犬病毒（RV）是否存在。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒樣本處理和要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心月20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如果出現沉淀，需要再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心月20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如果有沉淀形成，需要再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心約20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如果有沉淀形成，需要再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心約20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心約20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如果有沉淀形成，需要再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍需保持在2-8℃。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心約20分鐘（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后應盡早進行提取，提取時要按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若果不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，必須避免反復凍融。

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒操作步驟：

1.編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）。

2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸碰到孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后防止在置于溫度為37℃的溫度下溫育30分鐘。 

4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 

7.溫育：同3。

8.洗滌：同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立即轉變為黃色）。

11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒結果判定：

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10臨界值（CUT OFF）。

計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15陰性。

判定：1、樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陰性陽性。

      2、樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陽性。