細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中CDK1/CYCLIN B特異活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中CDK1/CYCLIN B激酶的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

技術背景

細胞周期素依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又稱為細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34^cdk1，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為高度進化保留的激酶復合物，成熟促進因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亞體，含有297氨基酸，與細胞周期素B結合，允許細胞由G2期進入有絲分裂期以及由G1期進入DNA合成期，達到調節細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。其磷酸化目標序列為 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK，在ATP的存在下，受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析細胞周期素依賴性激酶1/細胞周期素B的特異活性。其反應方式為：

產品內容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）          毫升

酶促液（Reagent D）          微升

反應液（Reagent E）          微升

底物液（Reagent F）         微升

陰性液（Reagent G）          微升

產品說明書               1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

CDK1/CYCLIN B激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取65微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入10微升反應液（Reagent E）

4． 加入10微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

五、 計算樣品活性

六、 酶標儀測定

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動96孔板

10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數

11． 活性計算：

注意事項

1． 本產品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關重要 

6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘

8． 光度測定后，比色皿須清洗

9． 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12． 可以使用CDK1/CYCLIN B抑制劑（CGP74514A）作為抑制劑對照（IC50＝0.025微摩爾）或陰性對照

13． CDK1/CYCLIN B激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品