技術背景

多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一種鋅依賴性核酶，廣泛存在于真核細胞中。PARP家屬由18個成員，其中6個已經被證實，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-3、PARP-4（VPARP）、PARP-5a/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4個結構域構成：DNA結合、切離、自修飾（automodification）、催化等結構域。其功能在于特異性地識別DNA損傷產生的單鏈或雙鏈DNA斷裂，并與之結合而激活，催化將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉化成煙酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合體（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反應，由此引導各種DNA修復蛋白聚集到損傷部位，實施修復，同時調節染色質結構形成（chromatin structure formation）、 細胞分化、繁殖、發育、凋亡、基因表達等，以及對于心腦缺血的反應和腫瘤惡變的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中風、敗血癥等引起的組織損害。其中PARP-1由1014氨基酸殘基組成，分子量113Kd，是細胞ATP/NAD細胞凋亡系統的主要調節因子。基于人工合成底物ADP核糖對硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在損傷的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，釋放出顯色產物對硝基苯酚（p-nitrophenol），通過分光光度儀檢測吸光讀數的變化（405nm 波長），來定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反應系統為：

產品內容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應液（Reagent D）        微升

底物液（Reagent E）          微升

陰性液（Reagent F）          微升

產品說明書              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或酶標板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備（總蛋白制備）

1． 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長405nm，并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

5． 上下傾倒數次，混勻

6． 在25℃溫度下孵育2小時

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景讀數

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入5微升待測樣品（（20微克核蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白））（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數次，混勻

6． 在25℃溫度下孵育2小時

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數

五、計算樣品活性

六、 酶標板測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克核蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

6． 輕輕搖動酶標板

7． 在25℃溫度下孵育2小時

8． 即刻放進酶標儀檢測：獲得背景讀數和樣品讀數

9． 活性計算：

注意事項

1． 本產品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關重要 

5． 用戶可以選擇使用核蛋白替代產品中的總蛋白制備

6． 測定值由低到高變化；反應可持續2小時

7． 比色測定后，比色皿須清洗

8． 樣本測定2小時讀數高于背景讀數表明具有酶活性

9． 建議待測樣本蛋白濃度：核蛋白為20微克/5微升；總蛋白為100微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

11． 多聚ADP核糖聚合酶-1單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每小時內能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位

12． 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感