組織總抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量檢測試劑盒產品說明書 | ||||||||||||||||||||||||
點擊次數:1398 更新時間:2023-05-08 | ||||||||||||||||||||||||
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組織總抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量檢測試劑盒產品說明書
主要用途
組織總抗氧化能力(TAC)比色法(DPPH)定量檢測試劑是一種旨在通過有機氮自由基染料DPPH的參與,在抗氧化劑的存在下,通過分光光度儀,觀察其峰值下降的變化,來定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力,即消除自由基等值濃度的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種新鮮組織(動物、人體、植物、昆蟲等)的總抗氧化能力檢測。可以被用于細胞凋亡、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡易,性能穩定。
技術背景
超氧自由基陰離子(superoxide radical;O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide;H2O2)、羥自由基或氫氧基(hydroxyl radical;OH-)、過氧化基(peroxyl radical;ROO-)、氫過氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO-)、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion;ONOO-)次氯酸(hypocorous acid;HOCl)、半醌自由基(semiquinone radical)、單線態氧氣(singlet oxygen)等細胞內活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的產生和增多,將導致細胞衰老或凋亡,甚而導致諸如冠心病、風濕性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統內,通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等,大分子,例如白蛋白、銅藍蛋白(ceruloplasmin;CER)、鐵蛋白(ferritin)和抗氧化因子,例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素(bilirubin)等,產生抗氧化能力,即捕獲自由基的能力,達到消除或降低ROS的損害。通過穩定的有機氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical;DPPH),受到抗氧化劑的去自由基作用,呈現深紫色轉化為黃色的變化,衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力,在分光光度儀(515nm波長)的幫助下,觀察其峰值下降的變化,并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。
產品內容
清理液(Reagent A) 250毫升 低滲液(Reagent B) 25毫升 緩沖液(Reagent C) 20毫升 染色液A(Reagent D1) 1瓶 染色液B(Reagent D2) 10毫升 標準液(Reagent E) 200微升 產品說明書 1份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里,有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管:用于組織樣品操作的容器 2毫升離心管:用于組織樣品操作的容器 1.5毫升離心管:用于組織裂解懸液存放的容器 4℃微型臺式離心機:用于樣品操作 超聲儀:用于破碎組織細胞 200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于比色的容器 分光光度儀或酶標儀:用于比色分析
實驗步驟
一、 樣品準備
1. 手術取出動物組織,并秤重以確定組織重量200毫克 2. 移入到一個液氮凍存管 3. 即刻放進液氮罐過夜 4. 次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融) 5. 放進一個15毫升錐形離心管 6. 加入2毫升4℃預冷的 清理液(Reagent A) 7. 強力渦旋震蕩30秒,充分混勻 8. 轉移到4℃預冷的2毫升離心管 9. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 10. 小心抽去上清液 11. 加入1毫升4℃預冷的 清理液(Reagent A),混勻 12. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為400g(或2000RPM,例如eppendorf 5415) 13. 小心抽去上清液 14. 重復實驗步驟11至13二次 15. 加入500微升低滲液(Reagent B),混勻 16. 置于200瓦超聲儀槍頭下,離心管在冰槽里 17. 超聲功率為100%,猝擊10秒,2個循環 18. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g(或10000RPM,例如eppendorf 5415) 19. 移取上清液到新的4℃預冷的1.5毫升離心管 20. 移取10微升進行蛋白定量檢測(建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1) 21. 使用清理液(Reagent A)調整蛋白濃度為100微克/10微升 22. 置于冰槽里待測
二、標準液準備
1. 準備好5個1.5毫升離心管,標記為1至5號管 2. 分別加入50微升緩沖液(Reagent C)到2至5號管 3. 移取100微升標準液(Reagent E)到1號管,混勻 4. 小心移取50微升1號管的標準液(Reagent E)到2號管,混勻 5. 小心移取50微升2號管稀釋的標準液(Reagent E)到3號管,混勻 6. 小心移取50微升3號管稀釋的標準液(Reagent E)到4號管,混勻 7. 將1至5號管放進冰槽里備用,避免光照;標準管濃度見下表
三、 樣品測讀
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化,移取5毫升染色液B(Reagent D2)到1瓶染色液A(Reagent D1)里,混勻,置于暗室里,標記為染色工作液,避免光照。然后進行下列操作。
1. 準備1個96孔板,做好標記:空白對照孔、標準樣品孔、待測樣品孔 2. 分別移取205微升緩沖液(Reagent C)到96孔板里的每個孔里 3. 分別加入25微升染色工作液 4. 加入20微升緩沖液(Reagent C)到空白對照孔 5. 加入20微升上述配制的標準液(Reagent E)到相應標準樣品孔里 6. 加入20微升樣品(100微克蛋白總量)到待測樣品孔里 7. 輕輕搖動96孔板,使其混勻 8. 室溫下孵育15分鐘 9. 即刻放進酶標儀里測讀:515nm波長 10. 分析結果: 1) 構建標準曲線:縱座標(Y軸)為吸光單位(OD515nm);橫座標(X軸)為標準Trolox濃度(微摩爾/升) 2) 空白對照孔為最大吸光單位(OD515nm)讀數 3) 標準樣品孔和待測樣品孔為實際吸光單位(OD515nm)讀數 4) 根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度(微摩爾/升) 5) 計算樣品實際總抗氧化能力 【根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度(微摩爾/升)×0.25(體系容量:毫升)×樣品稀釋倍數】÷0.02(樣品容量:毫升)=(微摩爾/升TROLOX等值) 6) 根據下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力(實際抑制百分率) 【(空白對照孔吸光單位讀數-實際吸光單位讀書)÷空白對照孔吸光單位讀數】×100% 7) IC50:50%抑制率所需的樣品單位:TROLOX等值或樣品蛋白量(毫克/毫升)或樣品容量(微升) X(所需樣品單位)=(已知樣品單位÷實際抑制百分率)×50%
注意事項
1. 本產品為50次操作,包括標準品 2. 本產品測試范圍為10至100微摩爾Trolox等值 3. 操作時,須戴手套 4. 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態下進行 5. 用戶可以調整標準曲線區間 6. 測試前,樣品須新鮮收集 7. 樣品須清澈 8. 空白對照孔的吸光讀數應為1.0左右為佳 9. 樣品讀數越低,抗氧化能力越高 10. 可以使用比色皿檢測 11. 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低, 建議稀釋或增加樣品容量或濃度 12. 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/20微升(本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1) 13. 如果測試樣品很多,建議使用排槍移液 14. 本公司提供系列抗氧化分析試劑產品
質量標準
1. 本產品經鑒定性能穩定 2. 本產品經鑒定檢測敏感
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