主要用途

 細胞培養液氧化應激活性氧（ROS）光澤精化學發光法定量檢測試劑是一種旨在通過使用自由基  探針光澤精， 捕獲細胞培養上清液中的活性氧族， 使發光物氧化降解并發光， 在化學發光儀（Luminometer） 的幫助下定量檢測細胞培養液活性氧族（超氧自由基陰離子） 的生成和數量的而經典的技術方法。該  技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物和人體細胞培養液的活性氧族的檢測。 產  品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基   （hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷   氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等   細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕  性關節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-N- 甲基吖啶翁

（bis-N-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發光劑，單價還原后生成光澤精自由基，再與超氧自 由基陰離子反應生成不穩定的中間物光澤精二惡二酮， 由此分解成電激發狀態（N－甲基丫啶酮），通過釋 放光子，回復到基態。光澤精作為探針，可以特異性檢測細胞培養系統超氧自由基陰離子，其發光強度與 超氧自由基陰離子水平成正相關。

產品內容

 清理液（Reagent A）

 發光液（Reagent B）

產品說明書

保存方式

毫升

毫升

1 份

保存  發光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里， 嚴格避免光照； 其余的保存在 4℃冰箱里， 有效保

證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

臺式離心機：用于去除樣品雜質

測試管：用于發光檢測用的專用試管

化學發光儀：用于檢測化學發光

實驗步驟

一、 樣品預處理

1 ． 準備 1 瓶 25cm2細胞培養瓶的新鮮待測細胞

2 ． 小心移取細胞培養液到 15 毫升錐形離心管

3 ． 放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 300g

4 ． 小心移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管

5 ． 根據上清液容量和細胞數，計算出（N） X 106細胞/毫升

6 ． 放進 37℃培養箱里備用（1 小時內）

二、 測讀

測讀開始前， 打開化學發光儀， 設定儀器內溫度為 37℃預熱和整合測讀 10 秒或 15 分鐘； 然后關掉實驗室 的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。

1 ． 準備好測試管，做好標記：陰性對照、樣品本底和樣品活性

2 ． 移取 xx 微升  清理液（Reagent A）到陰性對照測試管

3 ． 移取 400 微升上述預處理的細胞培養液到樣品本底測試管

4 ． 移取 400 微升上述預處理的細胞培養液到樣品活性測試管

5 ． 分別加入 xx 微升  發光液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管

6 ． 輕輕渦旋混勻

7． 即刻放進 37℃化學發光儀里測讀

8． 整合測讀 10 秒，獲得相對發光單位（relative light unit；RLU）

9． 或者整合測讀 15 分鐘， 獲得光電子讀數： X 106 CPM（counted photon per minute）（注意： 可以使用液 體閃爍儀替代）

10．計算 ROS 水平：

（樣品活性－樣品本底）  ÷              細胞】＝X  106 CPM/毫升＝X  106 CPM/【（N）X 106   細胞】

注意事項

1 ． 本產品為 50 次操作

2 ． 如果測定體系變化，則試劑用量相應變化

3 ． 操作時，須戴手套

4 ． 測試前，細胞培養液須新鮮收集， 1 小時內為最佳

5 ． 樣品制備后即刻測讀，不宜過夜保存

6 ． 培養液上清須澄清

7 ． 必要時，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理

8 ． 測讀的所有步驟均須在暗室里進行

9 ． 如果是注射式化學發光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學發光儀注射（injector）管道 10 ．本公司提供系列活性氧分析試劑產品

質量標準

1 ． 本產品經鑒定性能穩定

2 ． 本產品經鑒定檢測敏感