DNase I 溶液使用說明 | ||||||||||||||||||||||
點擊次數:1001 更新時間:2023-04-14 | ||||||||||||||||||||||
產品簡介: DNase I , 即 Deoxyribonuclease I , 即脫氧核糖核酸酶 I , 是一種可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase I 水解單鏈或雙 鏈 DNA 后的產物, 5'端為磷酸基團,3'端為羥基。 DNase I 活性依賴于鈣離子, 并能被鎂離子或二價錳離子激活 。鎂離子存在條件下, DNase I 可隨機剪切雙鏈 DNA 的任意位點;二價錳離子存在條件下,DNase I 可在同一位點 剪切 DNA 雙鏈,形成平末端, 或 1 -2 個核苷酸突出的粘末端。 特點:不含 RNase (RNase free), 可以用于各種 RNA 樣品的處理 。提供了用于 DNase I 失活所需的 EDTA。 用途:制備不含 DNA 的 RNA 樣品;RT -PCR 反應前 RNA 樣品中去除基因組 DNA 等可 能的 DNA 污染;體外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 轉錄后去除 DNA 模板; DNase I footprinting 研究 DNA -蛋白質相互作用; 缺口平移(nicktranslatioin); 產生 DNA 隨 機片段文庫; 細胞凋亡 TUNEL 檢測中部分剪切基因組 DNA 作為陽性對照。 來源:從牛胰腺純化得到 。分子量: 約 32kDa(單體)。 活性定義:37°C 10 分鐘內,將能夠降解 1 μg pBR322 質粒 DNA 所需的酶量定義為 1 個活性單位。 活性檢測條件:40mM Tris -HCl (pH8.0) , 10mM MgSO4, 1mM CaCl2 , 1 μg of pBR322 DNA 。純度:不含其它 DNA 內切酶和外切酶,不含 RNA 酶。 保存條件: -20°C 保存, 一年內有效。 操作流程: 1 RT -PCR 反應前 RNA 樣品中 DNA 的去除: 1.1 DNA 模板限制性核酸內切酶作用后線性化。酚/氯仿和氯仿/異丙醇提取 DNA,用乙醇沉 淀后, 溶于適量的無菌去離子水中。 1.2 向一無 RNA 酶的 EP 管中依次加入下列試劑:
注意:如需處理較大量的 RNA 樣品, 可以按照比例放大上述反應體系 。如果能在上述反應 體系中加入適量 Ribonuclease inhibitor 以防止 RNA 降解則更佳。 1.3 37°C 孵育 30min。 1.4 向上述反應體系中加入 1 μl 25mM EDTA,65°C 孵育 10min, 以失活 DNase I 。注意:在 沒有鏊合劑如 EDTA 等存在情況下加熱, RNA 可被水解。 1.5 上述加熱處理過的 RNA 樣品即可直接用于處理好的 RNA 可用作 RT -PCR 反應的模板。 2 體外 RNA 反轉錄后模板 DNA 的去除: 2.1 在每含有 0.5 μg 模板 DNA 的反轉錄反應體系中加入 1U DNase I 。注意:在某些情況下, 模板 DNA 消化所需的 DNase I 的量需通過實驗進行摸索。 2.2 37°C 孵育 15min。 2.3 酚/氯仿抽提失活 DNase I。 3 缺口平移進行 DNA 標記 3.1 參考如下表格設置反應
* 3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP):分別取除已經標記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM) 各 1 μl 加入到 97μl 的無核酸酶的去離子水中混勻即可 。例如標記的為 dATP,則需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三種 dNTP 至每種的最終濃度為 1mM。配制好的 dNTP 可存放于 -20°C 以備后續使用。 ** DNase I 可以用 1 × Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進行稀釋。 Reaction Buffer (10 ×) for DNA Polymerase I : 500mM Tris -HCl (pH7.5 at 25°C) , 100mM MgCl2 , 10mM DTT。 3.2 立即 15°C 孵育 15~60min。 3.3 上述反應體系中加入 1μl 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應。 3.4 從中取出少量例如 1 μl 檢測標記效率 。通常標記效率至少可以達到 108cpm/μg DNA。 3.5 可用 Sephadex G -50 或 Bio -Gel P -60 去除[α -32P]-dNTP, 以純化獲得標記的 DNA。 溫馨提示: 為了您的自身安全,使用試劑前,請做好防護,如穿實驗服, 帶手套等。 |
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