組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶活性比色法定量檢測試劑盒說明書 |
點擊次數:745 更新時間:2023-04-12 |
主要用途 組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶(KETOACYL COA THIOLASE)活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用酮脂酰輔酶A作為底物,在鎂離子和輔酶A的激活下,底物解離后峰值的降低,即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品(動物、人體、昆蟲等)長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。 技術背景 脂肪酸β氧化過程(β-oxidation)在動物組織的線粒體發生的脂肪酸代謝通路,可概括為活化、轉移、β-氧化及最后經三羧酸循環被氧化生成CO2和H2O,并釋放能量等四個階段。硫解酶(Thiolase)存在于真核和原核生物的細胞里,分成兩種類型:一種為酮脂酰輔酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase;EC: 2.3.1.16),另一種為乙酰乙酰輔酶A硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase;EC: 2.3.1.9)。酮脂酰輔酶A硫解酶又稱為硫解酶I(thiolase I),以各種鏈長脂肪酸為底物,催化脂肪酸β-氧化的最終反應,釋放乙酰輔酶A,同時產生短缺2個碳基的脂酰輔酶A。在真核生物中,酮脂酰輔酶A硫解酶又分為線粒體型和過氧化酶體型。長鏈酮脂酰輔酶A(例如酮十六脂酰輔酶A;3-ketohexadecanoyl-CoA)在長鏈硫解酶I的催化下,發生鎂-烯醇化物(Mg-enolate)的裂解,致長鏈酮脂酰輔酶A底物的減少,在分光光度儀(303nm)下,吸光值降低,來定量分析長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性。長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶反應系統為: 用戶自備 1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器 15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器 (微型)臺式離心機:用于樣品操作 比色皿或96孔板:用于比色的容器 分光光度儀或酶標儀:用于比色分析 實驗步驟
一、樣品準備 1.手術取出動物組織,并秤重500毫克組織重量 2.(選擇步驟)放進預冷的15毫升錐形離心管 3.(選擇步驟)加入3毫升清理液(Reagent A)清洗 4.(選擇步驟)抽去清理液 5.移入到一個液氮凍存管 6.即刻放進液氮罐過夜 7.次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融) 8.放進一個15毫升錐形離心管 9.加入置于冰槽里的500微升裂解液(Reagent B) 10.強力渦旋震蕩30秒,充分混勻 11.放進冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時停止,放進-70℃冰箱里儲存備用) 12.即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g 13.小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管 14.移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1) 15.放進-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用 二、測定準備 1.開啟并設定好分光光度儀(溫度為25℃):波長303nm,間隔30秒,讀數5次(共3分鐘),并置零 2.從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化 3.緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度 三、背景對照測定 1.移取800微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿 2.加入50微升反應液(Reagent D) 3.加入100微升底物液(Reagent E) 4.上下傾倒數次,混勻 5.在25℃溫度下孵育3分鐘 6.加入50微升陰性液(Reagent F) 7.上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內) 8.即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(0分鐘讀數-3分鐘讀數) 四、樣品測定 1.移取800微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿 2.加入50微升反應液(Reagent D) 3.加入100微升底物液(Reagent E) 4.上下傾倒數次,混勻 5.在25℃溫度下孵育3分鐘 6.加入50微升待測樣品(10微克蛋白總量)(注意:樣品須清澈) 7.上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內) 8.即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(0分鐘讀數-3分鐘讀數) 五、計算樣品活性
[(樣品讀數-背景讀數)X樣品稀釋倍數]÷[0.05(樣品容量;毫升)X 13.5(毫摩爾吸光系數)X 3(反應時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 單位=微摩爾酮脂酰輔酶A /分鐘 六、酶標儀測定 1.在96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品 2.分別移取200微升緩沖液(Reagent C)到96孔板里 3.分別加入12.5微升反應液(Reagent D) 4.分別加入25微升底物液(Reagent E) 5.輕輕搖動96孔板 6.在25℃溫度下孵育3分鐘 7.分別加入12.5微升陰性液(Reagent F)或待測樣品(10微克蛋白)到相應孔中(注意:樣品須清澈) 8.輕輕搖動96孔板 9.即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數和3分鐘讀數 10.活性計算: [(樣品讀數-背景讀數)X樣品稀釋倍數X 0.25(體系容量;毫升)]÷[0.0125(樣品容量;毫升)X 13.5(毫摩爾吸光系數)X 0.6(光徑距離;厘米)X 3(反應時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 單位=微摩爾酮脂酰輔酶A/分鐘 |
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