主要用途

組蛋白脫乙酰化酶2（HDAC2）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過比色探針對硝基苯胺標(biāo)記乙酰化多肽底物，在特異性抑制劑的存在下，經(jīng)過HDAC脫乙酰基后，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對硝基苯胺，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞、組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或純化酶樣品中HDAC2的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2同源，包括SIRT1至7等。其曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感。通過催化組蛋白上賴氨酸殘基ε氨基酸的乙酰基團的水解脫離，改變核小體（nucleosome）結(jié)構(gòu)達到調(diào)節(jié)基因表達，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化，一旦失控，則會導(dǎo)致腫瘤和衰老。HDAC2（EC3.5.1.98），與各種不同蛋白，包括YY1，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，達到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進程、以及發(fā)育變化等控制作用。其脫乙酰化目標(biāo)序列為 XXXLys（Ac）X。基于乙酰化多肽具有抗氨基肽酶切離的功能，首先通過比色染料對硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來標(biāo)記乙酰化多肽底物，其次，在特異性抑制劑apicidin的差異濃度作用下，進行HDAC的脫乙酰化，最后底物進一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強烈吸光值的黃色對硝基苯胺（波長405nm），由此來定量測定組蛋白脫乙酰基酶2的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）                      毫升

底物液（Reagent B）                      微升

終止液（Reagent C）                      微升

酶解液（Reagent D）                      微升

補充液（Reagent E）                      微升

專性液（Reagent F）                      微升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent B）避免光照，有效保證6月

用戶自備

（微型）臺式離心機：用于細(xì)胞預(yù)處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

酶標(biāo)板或比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為37℃）： 波長405nm，并置零

二、活性測定

1） 總活性測定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對照和待測樣品總活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中

3． 分別加入xx微升底物液（Reagent B）

4． 分別加入xx微升補充液（Reagent E）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒

6． 放進37℃培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘，避免光照

7． 分別加入xx微升終止液（Reagent C）

8． 分別加入xx微升酶解液（Reagent D）

9． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒

10． 在37℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘

11． 即刻放進酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數(shù)

2） 非特異活性測定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品非特異活性

2． 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中

3． 加入xx微升專性液（Reagent F）

4． 加入20微升待測樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 放進37℃培養(yǎng)箱里，孵育10分鐘，避免光照

6． 加入xx微升底物液（Reagent B）

7． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒

8． 放進37℃培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘，避免光照

9． 加入xx微升終止液（Reagent C）

10． 加入xx微升酶解液（Reagent D）

11． 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板30秒

12． 在37℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘

13． 即刻放進酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數(shù)

3） 樣品活性計算

  （3）樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要

5． 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等

6． 孵育反應(yīng)完成后即刻進行比色測定

7． 濾波器可以使用波長400nm替代405nm

8． 測定值由低到高變化；測定可以持續(xù)60分鐘

9． 測定值吸光讀數(shù)越高，表明酶活性越高

10． 比色測定后，比色皿須清洗

11． 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HL30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

13． 組蛋白脫乙酰基酶2單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感