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ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑盒說(shuō)明書
點(diǎn)擊次數(shù):675 更新時(shí)間:2022-12-19
 

ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

 

主要用途

 

 ATP酶法冰凍切片人體肌肉組織分型染色試劑是一種旨在使鈣激活技術(shù),在堿性或酸性條件下,由三磷酸腺苷酶催化水解產(chǎn)生的磷酸與鈣離子結(jié)合,經(jīng)過(guò)氯化鈷的替換,最后在硫化銨存在的情況下,呈現(xiàn)組織樣本中酶活性部位的不同深淺棕色沉淀現(xiàn)象的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于人體組織冰凍切片的酶活性檢測(cè),即人體肌肉組織纖維的分型鑒定。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,靈敏牢固,顯色清晰。

 

技術(shù)背景

三磷酸腺苷酶或ATP酶(adenosinetriphosphataseATPase)可催化ATP水解生成ADP及無(wú)機(jī)磷的反應(yīng),這一反應(yīng)放出大量能量,用于運(yùn)送離子進(jìn)出細(xì)胞,同時(shí)供給生物體進(jìn)行需能生命過(guò)程。它存在于生物細(xì)胞的多個(gè)部位,比如肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜上,對(duì)整個(gè)生命的維持有著重要的作用。其中骨骼肌受到神經(jīng)沖動(dòng)的刺激,肌漿內(nèi)鈣離子濃度升高肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵ATP酶(sarcoplasmic or endoplasmic reticulum calcium ATPasesSERCA激活,分解ATP釋放能量,肌肉收縮。人類肌肉由兩種纖維構(gòu)成,I型或紅肌,又稱為慢纖維(slow twitch),和II型或白肌,又稱為(fast twitch)。I型和II肌纖維混合鑲嵌排列成棋盤樣(checkerboard"結(jié)構(gòu)。在身體里,I型和II型纖維的比例取決于肌肉在機(jī)體中的位置和它的功能,相較于II型肌,I型肌的肌球蛋白含量高,線粒體多,毛細(xì)血管密度高,糖原低,適合于有氧呼吸,持久收縮。一般的肌肉其纖維分布是II型纖維(6065%2倍于I型纖維。通過(guò)ATP酶染色,可以顯示兩型肌纖維,輔助診斷神經(jīng)源性肌、脊髓性肌肉等。三磷酸腺苷酶(ATP酶)水解三磷酸腺苷為二磷酸腺苷和磷酸,并釋放出能量。磷酸與鈣離子結(jié)合,在酶活性處形成無(wú)色的磷酸鈣,磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷,再經(jīng)硫化銨處理形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。

產(chǎn)品內(nèi)容

 

堿性液(Reagent A                    15毫升

酸性液(Reagent B                     5毫升

反應(yīng)液(Reagent C                     1毫升

激活液(Reagent D                    30毫升

置換液(Reagent E                    20毫升

清理液(Reagent F                   250毫升

顯色液(Reagent G                    10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書                1

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液(Reagent C顯色液(Reagent G在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保證6

 

 

用戶自備

 

蘇木素復(fù)染試劑盒(HL80067):用于選擇性染色后復(fù)染

2毫升離心管:用于工作液配制的容器

培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)孵育

小型染色缸:用于染色清洗操作

光學(xué)顯微鏡:用于染色后觀察分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液(Reagent C置入冰槽里融化,然后移出200微升到2毫升離心管里,加入1.8毫升堿性液(Reagent A,混勻后,標(biāo)記為反應(yīng)工作液置于冰槽里備用(注意:5次操作量)。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、 樣本激活處理

 

1. 取出2待測(cè)的510微米厚的冰凍組織切片,標(biāo)記為12(注意:參見(jiàn)注意事項(xiàng)34

2. 小心加上200微升堿性液(Reagent A1號(hào)切片上,鋪滿整個(gè)樣品表面(注意:滴液前,用手芯焐熱試劑至室溫)

3. 室溫下孵育2分鐘

4. 同時(shí)小心加上200微升性液(Reagent B2號(hào)切片上,鋪滿整個(gè)樣品表面

5. 室溫下孵育2分鐘

6. 小心移去2號(hào)切片上性液(Reagent B注意:滴液前,用手芯焐熱試劑至室溫)

7. 室溫下,小心將2號(hào)切片置入50毫升清理液(Reagent F中孵育1分鐘,,期間輕輕攪拌

8. 小心移去1號(hào)切片上堿性液(Reagent A2號(hào)切片上的清理液(Reagent F

9. 分別加上200微升反應(yīng)工作,鋪滿整個(gè)樣品表面(注意:滴液前,用手芯焐熱試劑至室溫)

10. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里,孵育30分鐘(注意:如果染色較淺,建議延長(zhǎng)時(shí)間至60分鐘)

11. 小心移去反應(yīng)工作

12. 小心加上200微升激活液(Reagent D),鋪滿整個(gè)樣品表面

13. 室溫下孵育3分鐘

14. 小心移去 激活液(Reagent D

15. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1214二次

二、樣本染色處理

1. 小心加上200微升置換液(Reagent E,鋪滿整個(gè)樣品表面

2. 室溫下孵育3分鐘

3. 小心移去置換液(Reagent E

4. 室溫下,小心將切片置入50毫升清理液(Reagent F中孵育2分鐘,,期間輕輕攪拌(注意:如果染色出現(xiàn)雜質(zhì),建議使用無(wú)離子水沖洗)

5. 小心移去切片上的清理液(Reagent F

6. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟45一次(注意:清洗不干凈,可見(jiàn)棕黑色殘?jiān)w粒)

7. 小心加上200微升顯色液(Reagent G,鋪滿整個(gè)樣品表面

8. 室溫下孵育2分鐘;或持續(xù)孵育直至可見(jiàn)和深棕為止(注意:如果染色較淺,建議置于37孵育,避免干枯)

9. 小心移去顯色液(Reagent G

10. 室溫下,小心將切片置入50毫升清理液(Reagent F中孵育2分鐘

11. 小心移去切片上的清理液(Reagent F

 

三、 (選擇步驟)樣本復(fù)染處理

 

1. (選擇步驟)樣本復(fù)染處理(蘇木素)

2. 放上蓋玻片或封片

3. 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察

肌纖維類型

1號(hào)切片

2號(hào)切片

淺棕色

棕色

A

棕色

棕色

B

棕色

中度棕色

 

注意事項(xiàng)

 

1. 本產(chǎn)品為20次操作

2. 操作時(shí),須帶手套

3. 建議使用異戊烷(isopentane快速冷凍組織,避免切片冰晶形成

4. 冰凍切片不固定和包埋處理;避免干片

5. 試劑溶液在樣品表面時(shí),避免有氣泡存在,同時(shí)確保鋪滿樣品表面

6. 組織細(xì)胞染色注意不要過(guò)度

7. 可以使用有機(jī)溶劑(乙醇、二甲苯等)脫水、透明處理后封片 

8. 組織細(xì)胞染色完成后,即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察,否則會(huì)逐漸褪色 

9. ATP酶染色參考圖像:

11號(hào)切片 

22號(hào)切

10. 本公司提供系列特定組織染色試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰