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體液糖胺多糖(GAG)總含量二甲基亞甲基藍比色法定量檢測試劑盒
點擊次數:1698 更新時間:2022-12-09
 

19239.4 v.A

 

體液糖胺多糖(GAG)總含量二甲基亞甲基藍(DMMB)比色法定量檢測

試劑盒產品說明書

 

主要用途

 

體液糖胺多糖(GAG)總含量二甲基亞甲基藍(DMMB)比色法定量檢測試劑是一種旨在通過高鹽萃取可溶性糖胺多糖,二甲基亞甲基藍染料結合,在丙醇解離溶液中,釋放紫染料,由分光光度儀比色分析,定量檢測組織樣品中糖胺多糖含量的而經典的技術方法。該技經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種人體或動物體液(例如腦脊液、關節滑液、尿液等),以及細胞培養液的糖胺多糖水平檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,檢測準確。

 

技術背景

 

糖胺多糖(glycosaminoglycan;GAG),又稱為粘多糖(mucopolysaccharide),是體內最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負電荷性長鏈多聚糖,由重復的二糖單位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛酸(hexuronic acid),鏈接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖與核心蛋白(core protein)共價相聯,構成蛋白多糖(proteoglycanPG),成為細胞膜和細胞外基質(extracellular matrix;ECM)的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發生硫酸酯化(sulfated group),其部位在ON位上,有利于發揮各種不同的作用,包括酶的調節、細胞黏附、生長、遷移、分化,以及組織損傷反應。基于糖胺多糖的高度負電荷的特點,使用異染性(metachromatic)陽離子藍色染料二甲基亞甲基藍(1,9-dimethylmethylene blue;DMMB),在酸性條件下,特異性的結合產生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復合物(Dye-GAG complex,在丙醇解離溶液中,釋放出染料,通過分光光度儀(656nm波長)測定,來定量分析糖胺多糖的總含量。 

 

產品內容

 

清理液Reagent A                1毫升

萃取液Reagent B                1

染色液(Reagent C            25毫升

解離液(Reagent D            25毫升

標準液(Reagent E           100

產品說明書            1

 

保存方式

 

保存萃取液(Reagent B在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里染色液(Reagent C避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀:用于樣品反應

微型臺式離心機:用于樣品操作

比色皿或96孔板:用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀:用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、樣品預處理  

 

1. 準備好1.5毫升離心管

2. 移取1毫升液體尿液/腦脊液/唾液/精液/關節液/培養液樣品到離心管

3. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415

4. 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管

5. 加入50萃取液(Reagent B 

6. 強力渦旋震蕩1分鐘,充分混勻

7. 放進56℃恒溫水槽孵育16小時

8. 放進90恒溫水槽孵育10分鐘

9. 放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

10. 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管

11. 置于冰槽里備用

 

二、標準樣品配制

 

1. 準備好51.5毫升離心管,標記為15號管

2. 分別加入50微升清理液(Reagent A15號管

3. 移取50微升標準液(Reagent E1號管,混勻

4. 小心移取50微升1號管稀釋標準液(Reagent E2號管,混勻

5. 小心移取50微升2號管稀釋的標準液(Reagent E3號管,混勻

6. 小心移取50微升3號管稀釋的標準液(Reagent E4號管,混勻

7. 15號管放進冰槽里備用;標準管濃度見下表

 

管號

清理液(Reagent A

標準液(Reagent E

標準糖胺多糖含量

1

50微升

50微升

5微克

2

50微升

50微升1號管

2.5微克

3

50微升

50微升2號管

1.25微克

4

50微升

50微升3號管

0.625微克

5

50微升

0

0

 

三、 標準曲線測定

 

1. 移取50微升上述配制的標準液(Reagent E1.5毫升離心管

2. 加入1毫升染色液(Reagent C

3. 渦旋震蕩15

4. 室溫下孵育30分鐘,避免光照,期間每隔5分鐘渦旋震蕩15

5. 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為16000g

6. 小心抽去上清液(注意:確保沒有水滴殘留)(注意:可見紫色或粉紅色沉淀)

7. 加入1毫升解離液(Reagent D

8. 渦旋震蕩15

9. 室溫下孵育5分鐘,避免光照(注意:確保充分溶解)

10. 轉移到新的比色皿

11. 即刻放進分光光度儀檢測(波長656nm):獲得標準樣品吸光讀數

12. 重復實驗步驟111四次

13. 構建標準曲線:縱座標(Y軸)為吸光讀數;橫座標(X軸)為標準糖胺多糖含量微克

 

四、 樣品測定

 

1. 加入50微升上述制備待測樣品1.5毫升離心管

2. 加入1毫升染色液(Reagent C

3. 渦旋震蕩15

4. 室溫下孵育30分鐘,避免光照,期間每隔5分鐘渦旋震蕩15

5. 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘,速度為16000g

6. 小心抽去上清液(注意:確保沒有水滴殘留)(注意:可見紫色或粉紅色沉淀)

7. 加入1毫升解離液(Reagent D

8. 渦旋震蕩15

9. 室溫下孵育5分鐘,避免光照(注意:確保充分溶解)

10. 轉移到新的比色皿

11. 即刻放進分光光度儀檢測(波長656nm):獲得樣品吸光讀數

12. 根據上述標準曲線獲得樣品對應糖胺多糖含量(微克)

 

五、 濃度計算

 

根據上述標準曲線樣品對應糖胺多糖含量(微克)÷0.050(樣品量;毫升)=微克糖胺多糖/毫升 

 

注意事項

 

1. 本產品為25次操作,包括標準樣品

2. 本產品不適合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明質酸(hyaluronate的檢測

3. 本產品可以檢測硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、硫酸類肝素(heparan sulfate)等主要糖胺多糖

4. 本產品檢測范圍為0.25微克糖胺多糖

5. 操作時,須戴手套

6. 系統操作時,標準樣品測定只需1

7. 空白對照讀數通常小于0.06,如果超過表明抽去上清操作不當

8. 孵育時,避免光照

9. 如果樣品糖胺多糖含量過低,可以濃縮樣品或增加樣品量至100微升

10. 樣品濃度可以表述為:微克糖胺多糖/總蛋白等

11. 本公司提供系列糖類代謝檢測試劑產品

 

 

質量標準

 

1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感