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細胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書
點擊次數:923 更新時間:2022-12-05
 

主要用途

 

細胞胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyaseCGL)活性光度法定量檢測試劑是一種旨在運用胱硫醚作為底物,在裂解酶的催化下,產生半胱氨酸,使用Ellman試劑,呈現黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物吸光峰值的變化,即采用光度法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的其適用于各種細胞裂解懸液或純化酶樣品胱硫醚-γ-裂解的活性檢測,以及抑制劑篩選。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。

 

技術背景

 

胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyaseCGLEC4.4.1.1),又稱為胱硫醚酶(cystathionase),是轉硫化(transsulfuration)通路中的關鍵酶之一。在細菌、真菌和植物中,為正向(forward)轉硫化,而在哺乳動物、真菌和某些細菌為逆向(reverse)轉硫化,構成含硫氨基酸半胱氨酸(cysteine)和蛋氨酸(methionine)的相互轉換,調節高半胱氨酸濃度和半胱氨酸合成,并參與谷胱甘肽合成。胱硫醚-γ-裂解酶為輔基5-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphatePLP)依賴性酶,催化胱硫醚(cystathionine)降解為半胱氨酸、2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)和氨并具有催化高絲氨酸(homoserine)消去反應(elimination reaction),產生2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)、氨和水;催化胱氨酸(cystine)消去反應,產生硫化半胱氨酸(thiocysteine)丙酮酸和氨;催化半胱氨酸的消去反應,產生丙酮酸、硫化氫和氨。胱硫醚-γ-裂解酶參與硫化氫代謝通路(第三種氣體性傳導介質gasotransmitter)調節,與血管松弛、炎性反應、凋亡、缺血再灌注、氧化應激等有關。人體胱硫醚-γ-裂解酶異常,會導致胱硫醚尿癥(cystathioninuria)、胱氨酸病(cystinosis)、惡性淋巴細胞病變等疾病,對于酒精性肝損傷敏感。基于底物胱硫醚,胱硫醚-γ-裂解酶的催化下,產生半胱氨酸、2-丁酮酸甲酯(α-ketobutyrate)和氨,進而半胱氨酸側鏈巰基與Ellman試劑5,5-二硫基-雙(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid);DTNB]反應后,產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acidTNB,通過其吸收峰值的變化412nm波長,來定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反應系統為:

 

產品內容

 

清理液(Reagent A        毫升

裂解液(Reagent B        毫升

緩沖液(Reagent C        毫升

反應液(Reagent D        

底物液(Reagent E        

陰性液(Reagent F          微升

顯色液(Reagent G         微升

產品說明書              1

 

保存方式

 

保存裂解液(Reagent B)、反應液(Reagent D底物液(Reagent E和顯色液(Reagent G在-20冰箱里其余的保存在4冰箱里;顯色液(Reagent G避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒:用于脫離貼壁細胞

(微型)臺式離心機:用于樣品制備

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀:用于光度分析

 

實驗步驟

 

一、 樣品準備

 

1. 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 106細胞)

2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化

5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細胞

6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始

7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻

10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩15

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管 

15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1

16. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、 測定準備

 

1. 開啟并設定好分光光度儀(溫度為37℃):波長412nm,并置零

2. 從-20℃冰箱里取出試劑置于冰槽里融化;反應液(Reagent D底物液(Reagent E顯色液(Reagent G避免光照

3. 緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度

 

三、 樣品背景對照測定

 

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升底物液(Reagent E

3. 加入xx微升陰性液(Reagent F

4. 加入20微升待測樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈

5. 上下傾倒數次,混勻

6. 37℃溫度下孵育30分鐘

7. 加入xx微升顯色液(Reagent G,混勻

8. 37℃溫度下孵育5分鐘

9. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品背景對照 

 

四、 樣品活性測定

 

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升反應液(Reagent D

3. 加入xx微升底物液(Reagent E

4. 加入20微升待測樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈

5. 上下傾倒數次,混勻

6. 37℃溫度下孵育30分鐘

7. 加入xx微升顯色液(Reagent G,混勻

8. 37℃溫度下孵育5分鐘

9. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數 

 

五、計算樣品活性

 

 

六、 酶標儀測定

 

1. 96孔板上做好相應標記:樣品背景對照和樣品活性

2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C96孔板的所有孔里

3. 加入xx微升陰性液(Reagent E到樣品背景對照孔里

4. 加入xx微升反應液(Reagent D到樣品活性孔里

5. 分別加入xx微升底物液(Reagent E到所有孔里

6. 分別加入20待測樣品(100微克蛋白)到所有(注意:樣品須清澈

7. 輕輕搖動96孔板

8. 37℃溫度下孵育30分鐘

9. 分別加入xx微升顯色液(Reagent G所有

10. 輕輕搖動96孔板

11. 37℃溫度下孵育5分鐘

12. 即刻放進酶標儀檢測:獲得背景和樣品活性讀數

13. 活性計算:

 

 

 

注意事項

 

1. 本產品為20次操作,包括背景對照

2. 操作時,須戴手套

3. 系統操作過程中,背景測定只需1

4. 樣品須澄清,至關重要

5. 測定值由變化

6. 光度測定后,比色皿須清洗

7. 反應時間持續30分鐘

8. 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升(本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1

9. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

10. 可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制劑DL-炔丙基甘氨酸DL-Propargylglycine)作為抑制劑對照或陰性對照

11. 胱硫醚-γ-裂解酶單位活性定義為:在37pH 8.2條件下,每分鐘內產生1微摩爾半胱氨酸所需的酶量作為一個活性單位

12. 本公司提供系列轉硫化transsulfuration)通路分析試劑產品

 

質量標準

 

1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感