冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光（TMRM）檢測試劑盒產品說明書

主要用途

冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光（TMRM）檢測試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內呈現熒光染色，一旦釋放到細胞漿，其熒光性顯著降低，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍組織線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，分辨率高，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內容物釋放。其中鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線粒體內膜負電極結合而聚集；第三，容易進入細胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進入細胞后，被細胞內酯酶切離，產生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現強烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態。

產品內容

清理液（Reagent A） 60毫升

染色液（Reagent B） 50微升

稀釋液（Reagent C）  5毫升

產品說明書  1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和組織細胞染色的容器

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入500微升稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

1． 準備5片待測的厚為10微米的未經固著處理的冰凍切片

2． 置于室溫下，小心加上200微升預冷的清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面

3． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

4． 小心加上100微升室溫預熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面

5． 在37℃濕潤培養箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發）

6． 小心移去切片上的染色工作液，避免光照

7． 小心加上500微升清理液（Reagent A），鋪滿整個切片表面

8． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

9． 重復實驗步驟7和8一次

10． 放上蓋玻片或封片

11． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發波長540nm，散發波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強

注意事項

1． 本產品為50次操作

2． 操作時，避免污染母液

3． 操作時，須戴手套

4． 建議使用新鮮組織（手術切除后1小時內）制成的冰凍切片

5． 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃預熱

6． 建議組織染色完成后，即刻進行熒光檢測分析

7． 孵育時，必須避免光照

8． 本產品友好使用于雙重染色或重疊染色

9． 可以使用±10nm波長的濾波器

10． 本公司提供膜通道孔抑制劑： 0.2毫摩爾環胞素A（cyclosporine A）－12226，維護熒光完整

11． 本公司提供系列線粒體分析試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰

使用承諾

本公司秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。