主要用途

動物細胞V型氫ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶連續反應光度法定量檢測試劑是一種旨在使用V型氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，在特異性抑制劑存在與否的情況下，受到V型氫ATP酶的水解產生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物細胞裂解懸液等V型H^＋-ATP酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

氫ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質子或氫離子轉位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導過程中起著重要作用。其分成三類：質膜型（plasma membrane type或P型）、真細菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質膜上，約100kd蛋白；真細菌型存在于葉綠體、線粒體和細菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡型存在于真核生物細胞器的囊泡系統。其中植物質膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細胞膜上重要的功能酶，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶（V type H^＋-ATPase）是V型ATP酶的主要成員，400至600kd，含有胞漿復合體（V1）和胞膜復合體（V0），通過產生電子泵，轉移質子，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級活性轉運體的動力。V型氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。同時利用細胞內ATP釋放的能量逆向跨質膜把質子轉運出細胞，產生并保持細胞膜或細胞器兩側氫離子的電化學梯度，為一系列次級轉運體和通道蛋白對各種營養物質及離子的跨質膜轉運提供能量。動物V型氫ATP酶還參與細胞內以及細胞器（微粒體和溶酶體等）pH水平、液體分泌、跨膜電壓等多種生理過程的調節。基于底物ATP，在V型氫ATP酶敏感性抑制劑巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）存在與否的情況下，受到V型氫ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析V型氫ATP酶的活性。其反應系統為：

產品內容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

緩沖液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             毫升

反應液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）          毫升

陰性液（Reagent G）           毫升

專性液（Reagent H）              微升

產品說明書                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。

一、 樣品準備（總蛋白制備）

1． 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如動物細胞裂解樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數7次（共30分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xxx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘或30分鐘

四、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘或30分鐘

五、 樣品非特異活性測定

實驗開始前，移取50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白）到1.5毫升離心管，加入xx微升專性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混勻后，放進37℃培養箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進37℃培養箱里孵育3分鐘

6． 加入60微升上述預處理的待測樣品

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘或30分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項

1． 本產品為20次操作，包括背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5． 建議使用動物細胞微粒體、囊泡樣品；本公司提供的動物細胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒（10169.1）

6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定

7． 反應測定值由高到低變化；測定可以持續30分鐘

8． 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘或30分鐘測定讀數，表明有酶活性

9． 光度測定后，比色皿須清洗*

10． 建議待測樣本總蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）

11． 樣品特異活性是指巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）敏感性V型氫ATP酶活性

12． V型氫ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列ATP酶類分析技術產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確