主要用途

真菌/酵母細胞線粒體粗提分離試劑是一種旨在使用生物、化學和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母菌細胞壁，進一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細胞，從而分離出完整而純化的線粒體細胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品*佳。

技術(shù)背景

線粒體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                      250毫升

平衡液（Reagent B）                   250毫升

酶解液（Reagent C）                   500微升

裂解液（Reagent D）                        40毫升

凈化液（Reagent E）                    10毫升

強化液（Reagent F）                     5毫升

保存液（Reagent G）                   100毫升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存酶解液（Reagent C）和凈化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴格避免污染；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細胞收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃臺式高速離心機：用于分離細胞器成分

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

1． 準備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品

2． 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細胞/毫升；總量為5 X 10⁸細胞） 

3． 轉(zhuǎn)移到預冷的50毫升錐形離心管

4． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻

7． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

8． 小心抽去上清液

9． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

10． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

11． 小心抽去上清液

12． 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻

13． 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻

14． 放進30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻

15． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

16． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

17． 小心抽去上清液

18． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻

19． 放進30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實驗步驟21

20． 同時將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進行）

21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

22． 小心抽去上清液

23． 加入5毫升預冷的平衡液（Reagent B），混勻

24． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g

25． 小心抽去上清液

26． 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）的裂解工作液

27． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群

28． 選擇下列其中一種方法：

方法一：物理處理法

1． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器

2． 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20下）（注意：參見注意事項10）

3． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

4． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g

5． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

6． 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g

7． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

8． （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent G）

9． （選擇步驟）放進4℃臺式高速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g

10． （選擇步驟）小心抽去上清液

11． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻

12． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

方法二：化學處理法

1． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

2． 加入500微升預冷的強化液（Reagent F）

3． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

4． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項11）

5． 加入5毫升預冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動試管混勻

6． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g

7． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞

8． 放進4℃臺式高速離心機離心10分鐘，速度為10000g

9． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

10． （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent G）

11． （選擇步驟）放進4℃臺式高速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g

12． （選擇步驟）小心抽去上清液

13． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混勻

14． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次操作（50毫升菌液：1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞）

2． 其它實際操作的細胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標準用量的五分之一

3． 操作時，須戴手套

4． 操作時，避免污染母液

5． 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克

6． 細胞生長條件影響線粒體的質(zhì)量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)

7． 實驗步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行

8． 建議使用足夠的細胞量

9． 建議嚴格控制操作時間

10． 通常勻化次數(shù)為20下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

11． 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細胞會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)

12． 通常1克細胞濕重或5 X 10⁸細胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白，但不同菌株或培養(yǎng)條件會存在差異；建議使用純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒（HL10059）測定線粒體蛋白濃度

13． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

14． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量尤為理想

15． 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>，嚴格避免反復凍融

16． 如果需要獲得95％以上純度的線粒體，使用真菌/酵母細胞線粒體分離（高純）試劑盒（HL10049.3）

17． 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等

18． 線粒體內(nèi)外膜完整性測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色

19． 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等

20． 本公司提供系列真菌/酵母細胞線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正常活性

4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶