通用型細菌16S rDNA 熒光定量PCR擴增檢測試劑盒產品說明書

主要用途

通用型細菌16S rDNA 熒光定量PCR擴增檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，針對微生物樣本DNA進行保守性序列PCR擴增，實時檢測和定量分析擴增產物的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于各種樣品，包括血液、體液、組織、土壤等的細菌拷貝數的定量檢測。產品即到即用，性能穩定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強。

技術背景

16SrRNA作為非培養依賴性標記的分子指模（fingerprinting）技術，有別于傳統的選擇性培養技術，用于研究微生物的分類學（phylogenetics）。核糖體RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物體內，且結構與功能進化保留；容易分離和識別；其一級和二級結構具有高度進化保守區域（conserved region）和物種特異性可變區域（variable region）；其基因序列變異非常緩慢，且不會發生平行基因轉移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分；23S不穩定；而微生物16SrRNA基因較為穩定，初級結構含有1500個堿基。通過引物設計，擴增產物。SYBR綠色熒光染料，作為DNA結合染料，可以和擴增子（amplican）上雙鏈DNA的任一小溝（minor groove）結合，而發出熒光信號。根據每一循環的熒光強度來確定擴增產物的產量，并用循環閾值（threshold cycle；Ct）表示，計算獲得拷貝數。

產品內容

反應液（Reagent A）          300微升

染色液（Reagent B）           20微升

引物液（Reagent C）              40微升

補充液（Reagent D）          500微升

封隔液（Reagent E）          1.5毫升

產品說明書                 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品預處理的容器

1.5毫升離心管：用于預處理的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

PCR管：用于樣品擴增操作的容器

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作：

1． 一次反應總量為25微升

2． 移取15微升反應液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

3． 加入5微升待測的DNA模板（或 100納克）

4． 加入1微升染色液（Reagent B）

5． 加入2微升引物液（Reagent C）

6． 加入3微升補充液（Reagent D）至總容量為25微升

7． 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒

8． 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：參見注意事項10）

9． 即刻放進熒光定量PCR儀

10． 熒光定量PCR反應程序為：

11． 進行數據分析

（1） 采用比較閾值分析法（ΔΔCt），即相對定量，計算樣品拷貝數：建議使用用戶自備的對照樣品或大腸桿菌細菌株

（2） 或采用標準曲線法，即絕對定量，計算樣品拷貝數

（3） 細菌量單位計算：拷貝數/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數/微克樣品DNA（copies/µg）

A） 根據上述方法獲得待測樣品拷貝數（Q）

B） 根據下列公式計算單位拷貝數，即拷貝數/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數/微克樣品DNA（copies/µg）

C：單位拷貝數

Q：待測樣品拷貝數

VDNA：DNA萃取后的總容量

VPCR：反應體系中DNA模板容量（5微升）

VEXT：原始樣品總容量

注意事項

1． 本產品為20次PCR反應

2． 操作時，須戴手套

3． 樣品操作注意生物安全

4． 本產品適合各種熒光定量PCR儀

5． 建議整個操作在4℃下進行

6． 建議使用帶濾芯的槍頭，避免交叉污染

7． 使用時，避免污染母液