活體細胞溶酶體膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙熒光檢測試劑盒產品說明書

主要用途

活體細胞溶酶體膜通透性（LMP）/完整性吖啶橙熒光檢測試劑是一種旨在通過吖啶橙吸收和細胞內再分布檢測技術，選擇性地聚集在溶酶體內呈現熒光染色，即存在于或由溶酶體釋放到細胞漿的熒光染料的不同熒光強度變化，來分析和觀察溶酶體膜通透性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞溶酶體（動物、人體、昆蟲等）膜通透性的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

溶酶體（lysosome）是一種動態性的、多態性的、含有水解酶的細胞器，具有接受和降解來自于分泌性、內吞性（endocytic）、自噬性（autophagic）、吞噬性（phagocytic）膜運轉通路中的大分子。其功能是膜依賴性，具有解毒和防御作用。溶酶體膜是溶酶體內基質和胞漿之間的生理屏障，為整合性糖蛋白，防止細胞自我降解。一旦溶酶體膜去穩定（destabilization），例如堿性化或內容物移位（translocation），將導致質子和水解酶外漏，而造成細胞器功能異常，進而產生細胞壞死、凋亡，以及病理癥狀，例如朊病毒腦病（prion encephalopathies）、阿茨罕默病、心肌缺血、脊髓灰質炎病毒感染、補體激活型肺損傷（complement activation-produced lung injury）、急性組織損傷等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶體膜去穩定性或去完整性的標志之一，溶酶體內容物大量釋放到胞漿中，直接影響細胞的存活。吖啶橙（acridine orange；AO）是一種親溶酶體（lysomotropic）異染性（metachromatic）的熒光染料，在完整的溶酶體內，為質子化（protonated）寡聚體（oligomeric）形式，呈現紅色熒光（激發波長555nm，散發波長617nm），而在胞漿內，為單體去質子化形式，呈現綠色熒光（激發波長490nm，散發波長528nm）。吖啶橙進入溶酶體后重新分布，即吸收和細胞內再分布（uptake and redistribution），用于分析溶酶體膜通透性狀況。 

產品內容

清理液（Reagent A）           60毫升

染色液（Reagent B）          100微升

產品說明書   1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

24孔細胞培養板：用于貼壁細胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

微型臺式離心機：用于沉淀細胞

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實驗步驟

一、貼壁細胞染色

1．準備1個細胞培養24孔板的待測細胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見注意事項7）

2．小心抽去細胞培養液

3．小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A）到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

4．小心抽去清理液

5．小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A）到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

6．小心沿著孔壁加入5微升染色液（Reagent B）到1個細胞培養孔，覆蓋培養孔表面

7．放進37℃細胞培養箱里孵育15分鐘，避免光照

8．小心抽去染色液

9．小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A）到細胞培養孔

10．小心抽去清理液

11．重復實驗步驟9和10一次

12．小心沿著孔壁加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A）到細胞培養孔

13．選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發波長555nm，散發波長617nm――紅色熒光減弱，表明膜通透性（LMP）增強

（B）使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

激發波長490nm，散發波長528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增強

激發波長555nm，散發波長617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增強

二、懸浮細胞或脫離細胞染色

1．將懸浮細胞或脫離細胞（1 X 106細胞）移入到1.5毫升離心管

2．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

3．小心抽去上清液

4．加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群

5．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

6．小心抽去上清液

7．加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群

8．加入5微升含有染色液（Reagent B），充分混勻 

9．放進37℃細胞培養箱里孵育15分鐘，避免光照

10．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

11．小心抽去染色液

12．加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群

13．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心抽去上清液

15．重復實驗步驟12至14一次

16．加入500微升37℃預熱的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群

17．選擇下列方式之一進行操作：

a)進行細胞流式儀分析：FL1（激發波長488nm，散發波長528nm），或FL3（激發波長555nm，散發波長617nm）觀察10000個細胞以上――

FL1：波峰右移，表明膜通透性（LMP）增強

FL3：波峰左移，表明膜通透性（LMP）增強

b)或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

激發波長555nm，散發波長617nm――紅色熒光減弱，表明膜通透性（LMP）增強

c)或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進熒光分光光度儀：

激發波長490nm，散發波長528nm――RFU升高，表明膜通透性（LMP）增強

激發波長555nm，散發波長617nm――RFU降低，表明膜通透性（LMP）增強