真菌/酵母細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動力光度法定量檢測試劑盒產品說明書

主要用途

真菌/酵母細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）活性酶動力光度法定量檢測試劑是一種旨在通過特異反應系統中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）還原后峰值的增高，即采用光度法來測定真菌/酵母細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種真菌/酵母細胞裂解懸液樣品葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD；EC1.1.1.49）是一種細胞漿中的酶，參與磷酸戊糖代謝通路，通過維持還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平，提供細胞還原性能量，進而保持谷胱甘肽水平，幫助細胞，例如紅細胞，防止氧化損傷。同時NADPH的產生，促進組織細胞（例如肝臟、乳腺、脂肪組織、腎上腺等）生物合成脂肪酸、類異戊二烯等。在植物中，存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的多種異構體，位于細胞漿、質體基質（plastidic stroma）、和過氧化體。在酵母細胞中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷將干擾硫的還原性同化作用（reductive assimilation），增強對于過氧化氫的敏感等。基于葡萄糖-6-磷酸（D-glucose-6-phosphate）在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下，轉化為6-磷酸葡萄糖酸內脂（6-phosphoglucono-δ-lactone） 產物后，同時其輔酶因子氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP）轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH），通過測定吸光值的變化（340nm 波長），來定量分析葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應系統為：

G6PD

D-glucose-6-phosphate  +  β-NADP^＋  →   6-phosphoglucono-δ-lactone  +  β-NADPH

產品內容

裂解液（Reagent A）    10毫升

強化液（Reagent B）   2克

緩沖液（Reagent C）  10毫升

反應液（Reagent D）     1.25毫升

底色液（Reagent E）     1.25毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底色液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent A）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 加入100毫克強化液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里1分鐘
• 重復實驗步驟9至10五次
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）在室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入5微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品測定

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（5分鐘讀數－0分鐘讀數） 

五、計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升反應液（Reagent D）
• 分別加入25微升底色液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：5分鐘讀數和0分鐘讀數
• 活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘

注意事項

• 本產品為50次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 強化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用0.5毫升PCR管的蓋子內圈盛滿；或秤重0.1克
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加樣后3秒內光度測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續5分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定5分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內能夠轉化1微摩爾葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸內脂所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列醫學生化經典分析試劑產品