組織結構型內皮細胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測

試劑盒產品說明書

主要用途

組織結構型內皮細胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過一氧化氮合成酶反應系統，在內皮細胞一氧化氮合成酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，由底物L-精氨酸被催化產生一氧化氮，進而與熒光探針二氨基熒光素反應，生成強烈熒光產物三唑并熒光素，通過其相對熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定樣品中結構型內皮細胞一氧化氮合成酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）的結構型內皮細胞一氧化氮合成酶的特異活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，重復性好。

技術背景

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是鈣調蛋白（calmodulin）依賴性或含鈣調蛋白的細胞色素p450類血紅素蛋白（hemoprotein），分子量為130至160KD的二體蛋白，其催化結構域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黃素單苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在輔助因子四氫生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的幫助下，進行非芳香類氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧氣的參與下，成為一氧化氮（nitric oxide）的合成反應。一氧化氮合成酶有三種異構體：神經元型（neuronal NOS；nNOS；）、內皮細胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬細胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者為結構型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者為誘導型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。其中內皮細胞型（eNOS）為膜相關性蛋白（豆蔻酰化；myristoylation），分布在心血管以及腦血管組織，含有N-末端加氧酶、C-末端還原酶和鈣調蛋白結合結構域，其功能在于作為血管保護分子，維持血管緊張度（vascular tone）和完整性，同時受到鈣離子、鈣調蛋白、磷酸化等調節。基于底物L-精氨酸，在eNOS敏感性抑制劑亞胺乙基鳥氨酸（L-N⁵(1-iminoethyl)- L-ornithine；L-NIO）存在與否的情況下，通過NADPH和氧氣的參與，由一氧化氮合成酶催化產生一氧化氮氣體和瓜氨酸（citrulline）；進而使用特異性熒光探針二氨基熒光素（4,5-diaminofluorescein；DAF-2）與一氧化氮反應，生成強烈熒光產物三唑并熒光素（triazolofluorescein；DAF-2T），通過其相對熒光峰值的變化（激發波長495nm，散發波長515nm），來定量分析結構型內皮細胞一氧化氮合成酶的特異活性。其反應方式為： 

eNOS

L-arginine  +  NADPH  +  O2   →   nitric oxide  +  citrulline  +  NADP

L-NIO

DAF-2  +  NO +  O2  →  DAF-2T

產品內容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D）   1毫升

顯色液（Reagent E）   250微升

標準液（Reagent F） 100微升

專性液（Reagent G） 100微升

產品說明書      1份

保存方式

保存反應液（Reagent D）、顯色液（Reagent E）、標準液（Reagent F）和專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 顯色液（Reagent E）和標準液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

*緩沖液（Reagent H）：用于檢測純化內皮細胞型一氧化氮合成酶或體外檢測

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和標準品的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

恒溫水槽：用于反應孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于熒光分析的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實驗步驟

一、樣品準備

• 手術取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化（約80下）
• 將所有勻漿物移入2毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作