同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合物修復(fù)甲狀軟骨缺損 喬占清1，張 俊1，馬 賽1，馬振亞1，司遠(yuǎn)征1，喬新明2 (1南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校*附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南省南陽市 473058；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，鄭州大學(xué)*附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南省鄭州市 450001) 引用本文：喬占清，張俊，馬賽，馬振亞，司遠(yuǎn)征，喬新明. 同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合物修復(fù)甲狀軟骨缺損[J].中國組織工程研究，2016，20(12):1711-1717. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.006 ORCID: 0000-0001-7948-8704(喬占清) 文章快速閱讀： 文題釋義： 軟骨組織工程：是將軟骨種子種植于可生物降解、組織相容性好的生物材料上，形成復(fù)合物，然后再把該復(fù)合物植入軟骨缺損處，在生物材料自行降解的過程中，種植的細(xì)胞形成新的軟骨來填充缺損。 自體軟骨移植：Donald等采用異體軟骨移植的方式對不同類型軟骨缺損進行治療，并與自體軟骨缺損的臨床效果進行比較。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩種不同的軟骨移植方式在排斥率和感染率方面經(jīng)比較差異均無顯著性意義。但較之自體軟骨移植，異體軟骨移植存在明顯吸收現(xiàn)象。學(xué)者們還認(rèn)為，如果在臨床治療中利用良好的方法對異體軟骨予以妥善保存，則可顯著降低其移植后的吸收現(xiàn)象，達(dá)到與自體軟骨移植相同的治療效果。 異體軟骨移植：鄭信民等通過實驗發(fā)現(xiàn)，利用具有良好活力的同種異體軟骨進行軟骨修復(fù)治療可以獲得理想的臨床效果。在將同種異體軟骨植入人體之后，可以維持20年左右的存活時間且很少會出現(xiàn)明顯的吸收現(xiàn)象，臨床修復(fù)效果十分理想。 摘要 背景：將聚羥基乙酸支架與軟骨細(xì)胞復(fù)合，可獲得組織工程人工骨。 目的：觀察同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合物修復(fù)乳兔喉甲狀軟骨缺損的效果。 方法：取新西蘭成年大白兔20只，構(gòu)建喉甲狀軟骨缺損模型后隨機分組，實驗組于缺損處植入同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合物，對照組于缺損處植入聚羥基乙酸支架。植入后4，8周進行大體觀察、組織學(xué)觀察。 結(jié)果與結(jié)論：①大體觀察結(jié)果：植入后4周，實驗組軟骨缺損得到一定的修復(fù)，修復(fù)區(qū)域未出現(xiàn)壞死；對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結(jié)締組織。植入后8周，實驗組軟骨缺損得到進一步修復(fù)，修復(fù)界限不明顯；對照組軟骨缺損未得到修復(fù)，與周圍正常軟骨之間存在明顯界限。②免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：實驗組植入后4，8周的Ⅱ型膠原表達(dá)均高于對照組(P < 0.05)。結(jié)果表明同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合物可促進乳兔喉甲狀軟骨缺損的修復(fù)。 關(guān)鍵詞： 生物材料；軟骨生物材料；喉甲狀軟骨；軟骨缺損；同種異體軟骨細(xì)胞；聚羥基乙酸 主題詞： 甲狀軟骨；軟骨細(xì)胞；組織工程 Allogenic chondrocytes-polyglycolic acid compound for repair of thyroid cartilage defects Qiao Zhan-qing1, Zhang Jun1, Ma Sai1, Ma Zhen-ya1, Si Yuan-zheng1, Qiao Xin-ming2 (1Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473058, Henan Province, China; 2Basic School of Zhengzhou University, Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China) Abstract BACKGROUND: Tissue-engineered bone can be obtained by the combination of chondrocytes and polyglycolic acid scaffold. OBJECTIVE: To investigate the effect of allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound in the repair of thyroid cartilage defects in rabbits. METHODS: Twenty New Zealand adult rabbits were randomly divided into experimental group with implantation of allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound and control group with implantation of polyglycolic acid scaffold. Gross and histological observations were done at 4 and 8 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gross observation results: 4 weeks after surgery, cartilage defects in the experimental group were repaired certainly, and no necrosis appeared in the repair area; in the control group, the defects were filled with muscle and connective tissues. At 8 weeks after implantation, cartilage defects in the experimental group were further repaired, with unclear repair boundaries, and in the control group, cartilage defects were no repaired and showed a notable boundary with the surrounding normal cartilage tissues. (2) Immunohistochemical staining results: the expression of type II collagen in the experimental group was higher than that in the control group (P < 0.05) at 4 and 8 weeks after implantation. These findings indicate that the allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound can promote the repair of thyroid cartilage defects in rabbits. Subject headings: Thyroid Cartilage; Chondrocytes; Tissue Engineering Cite this article: Qiao ZQ, Zhang J, Ma S, Ma ZY, Si YZ, Qiao XM. Allogenic chondrocytes-polyglycolic acid compound for repair of thyroid cartilage defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(12):1711-1717. 0 引言 Introduction 喉是人體中一個十分重要的部位且結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，包含多種軟骨類型，包括環(huán)狀軟骨、會厭軟骨、甲狀軟骨和杓狀軟骨等[1]。這些軟骨一同聚集在小小的咽喉通道之中，對喉腔的正常力學(xué)狀態(tài)予以支撐和維持。但受到疾病及外傷等諸多因素的影響，極易導(dǎo)致喉部軟骨缺損的出現(xiàn)[2]，對患者的外觀產(chǎn)生一定的影響，引起失音及嗅覺變化等一系列問題[3]。以往修復(fù)喉甲狀軟骨缺損時，可采用患者自體軟骨移植方式[4]。Bhavana等[5]曾經(jīng)利用髂嵴作為移植物，治療喉氣管軟骨缺損，以實現(xiàn)聲門下喉重建。但患者自體軟骨來源十分有限，且在移植時不可避免地會對患者造成新的創(chuàng)傷，導(dǎo)致各種術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)，影響患者術(shù)后恢復(fù)[6]。 隨著臨床醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，組織工程學(xué)得到了較快發(fā)展，組織工程人工骨的出現(xiàn)也為各種喉軟骨損傷治療提供了新的方法。在進行修復(fù)時，需要結(jié)合不同患者軟骨缺損的具體情況進行組織人工骨構(gòu)建。構(gòu)建過程中需要具備種子細(xì)胞和理想的支架材料[7]。受到喉軟骨中空不規(guī)則結(jié)構(gòu)的影響，需要使用良好的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，相應(yīng)的材料應(yīng)該具備良好的機械強度、孔隙結(jié)構(gòu)及生物相容性等[8]。 現(xiàn)如今，軟骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料主要包括天然生物材料和各種人工合成生物材料等。其中聚羥基乙酸是一種常用的人工合成生物材料，具有良好的生物相容性和孔隙結(jié)構(gòu)，是一種理想的支架材料[9]，將其與軟骨細(xì)胞進行復(fù)合，可以獲得修復(fù)所需的人工骨。此次實驗過程中，從具有免疫力的乳兔體內(nèi)獲得軟骨細(xì)胞，并與聚羥基乙酸進行復(fù)合，獲得軟骨修復(fù)復(fù)合物，對喉甲狀軟骨缺損動物進行軟骨修復(fù)治療，以探討同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸復(fù)合物對有免疫力乳兔體內(nèi)喉甲狀軟骨缺損的修復(fù)效果。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 隨機對照動物實驗。 1.2 時間及地點 實驗于2015年7至8月在南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校*附屬醫(yī)院實驗室完成。 1.3 材料 聚羥基乙酸支架材料由廣州市濟源生物科技有限公司提供，原材料為聚乙醇酸，可降解，具有良好的生物相容性。 實驗動物：1周齡純種新西蘭健康乳兔21只，由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供，許可證號：SCXK(陜)2013-0006，健康狀況良好。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。 試劑與儀器： 1.4 實驗方法 乳兔軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[10]：取1只乳兔脫頸處死，在超凈工作臺上于無菌環(huán)境下切下雙膝，放入含雙抗的PBS內(nèi)。利用眼科剪游離軟骨予，之后添加胰蛋白酶。消化結(jié)束之后，添加含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。利用眼科將軟骨剪為小碎塊，添加Ⅱ型膠原酶，置于恒溫箱進行消化，獲得細(xì)胞懸液。利用150目網(wǎng)篩進行過濾，將過濾液置于離心管中進行離心，離心結(jié)束棄掉上清，添加含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)基，進行機械吹打，之后接種于培養(yǎng)瓶中，進行培原代和傳代培養(yǎng)。取第4代細(xì)胞，利用胰蛋白酶進行消化之后接種在96孔板中，連續(xù)培養(yǎng)10 d，添加MTT液進行孵育，添加DMSO溶解結(jié)晶物，利用酶聯(lián)免疫檢測儀對細(xì)胞在492 nm處的吸光度值進行檢測和記錄，根據(jù)檢測結(jié)果并繪制細(xì)胞生長曲線。 聚羥基乙酸支架材料處理：對聚羥基乙酸支架材料進行剪裁，剪為片狀，大小為1.2 cm×1.5 cm。利用多聚賴氨酸對材料進行浸泡，待材料*浸透之后取出，置于自然條件下進行風(fēng)干。干燥之后利用乙醇浸泡消毒，并使用三蒸水清洗。清洗結(jié)束后置于無菌培養(yǎng)皿中自然干燥，妥善保存?zhèn)溆茫⑷〔糠植牧线M行掃描電鏡觀察。 軟骨細(xì)胞復(fù)合聚羥基乙酸支架材料：復(fù)合之前利用紫外線對支架材料進行照射，之后對軟骨細(xì)胞進重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×1010 L-1。將軟骨細(xì)胞接種在支架材料上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。之后添加Ham-F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h之后換液。 實驗分組：取20只乳兔，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。兩組均構(gòu)建喉甲狀軟骨缺損模型，具體方法為：利用戊巴比妥對動物進行全麻，把動物固定在手術(shù)臺，對動物頸部進行脫毛和術(shù)區(qū)消毒，于動物頸部正中做切口，對肌層進行分離，暴露甲狀軟骨，從兩側(cè)甲狀軟骨板交界位置將軟骨切開，在一側(cè)甲狀骨板上造成0.6 cm×0.5 cm的缺損，連同內(nèi)外軟骨膜一并去除，保留喉黏膜，制備單側(cè)甲狀骨板缺損模型。單側(cè)甲狀骨板缺損模型制備完畢之后，實驗組動物植入同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合聚羥基乙酸支架材料，對照組植入同樣大小的聚羥基乙酸材料。植入結(jié)束后進行切口縫合。 術(shù)后處理：術(shù)后對兩組動物予以耳緣青霉素靜脈注射80×104 U，待動物清醒之后，對動物進行常規(guī)喂食、喂水。術(shù)后每天對兩組動物肌肉注射青霉素80×104 U，連續(xù)注射3 d，術(shù)后觀察動物一般情況，并進行記錄。 1.5 主要觀察指標(biāo) 植入后4周和8周，分別處死兩組動物各5只，獲得標(biāo)本進行觀察，了解喉甲狀軟骨缺損大體情況。利用Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒對兩組Ⅱ型膠原表達(dá)情況進行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，觀察兩組的Ⅱ型膠原表達(dá)陽性率，利用圖像分析軟件進行半定量分析。 1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗所得數(shù)據(jù)均利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進行分析，P < 0.05表示數(shù)據(jù)間差異有顯著性意義。 2 結(jié)果 Results 2.1 實驗動物數(shù)量分析 20只乳兔全部進入終結(jié)果分析，見圖1。 2.2 聚羥基乙酸支架材料掃描電鏡觀察 對聚羥基乙酸支架材料進行掃描電鏡觀察，可以觀察到支架材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，見圖2。 2.3 乳兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果觀察 對乳兔軟骨細(xì)胞進行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)1 d，細(xì)胞開始貼壁，呈短梭形、圓 形；培養(yǎng)3 d，細(xì)胞多呈三角形及多邊形，其胞漿豐富；培養(yǎng)10 d，可觀察到細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞之間相互連接，并呈現(xiàn)出“鋪路石”狀，見圖3。 2.4 乳兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體外生長情況檢測 利用酶聯(lián)免疫檢測儀對細(xì)胞在492 nm處的吸光度值進行檢測和記錄，按照檢測結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線，見圖4。 2.5 術(shù)后動物一般情況分析 術(shù)后兩組實驗動物均正常呼吸，呼吸維持在良好的通暢狀態(tài)，未出現(xiàn)喘鳴等情況，正常進食、飲水、活動，術(shù)后頸部傷口均一期愈合，未出現(xiàn)感染或死亡。 2.6 標(biāo)本大體情況分析 植入后4周：實驗組可觀察到軟骨缺損得到一定的修復(fù)，修復(fù)區(qū)域未出現(xiàn)壞死；對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結(jié)締組織。 植入后8周：實驗組軟骨缺損得到進一步修復(fù)，修復(fù)界限不明顯；對照組軟骨缺損未得到修復(fù)，與周圍正常軟骨之間存在明顯界限。 2.7 兩組Ⅱ型膠原表達(dá)分析 實驗組植入后4，8周的Ⅱ型膠原陽性率顯著高于對照組(P均< 0.05)，見表1，圖5。 3 討論 Discussion 喉部較易出現(xiàn)軟骨缺損，其中喉甲狀軟骨缺損十分常見，但軟骨的修復(fù)能力十分有限[11-13]。國外學(xué)者Kim等[14]通過研究指出，對于直徑在3 mm以下的軟骨缺損，可實現(xiàn)全部或者部分修復(fù)。但對于直徑在4 mm以上的軟骨缺損，依靠機體自身的修復(fù)能力則大多無法自行修復(fù)。 在進行軟骨修復(fù)時，采用自體軟骨移植是常用的方法，但受到來源和創(chuàng)傷等因素的影響，存在一定的應(yīng)用局限性[15-19]。隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，臨床開始積極的通過構(gòu)建組織人工骨的方式進行軟骨缺損修復(fù)治療[20-25]。鄭信民等[26]通過實驗發(fā)現(xiàn)，利用具有良好活力的同種異體軟骨進行軟骨修復(fù)治療可以獲得理想的臨床效果。在將同種異體軟骨植入人體之后，可以維持20年左右的存活時間且很少會出現(xiàn)明顯的吸收現(xiàn)象，臨床修復(fù)效果十分理想。Donald等[27]也采用異體軟骨移植的方式對不同類型軟骨缺損進行治療，并與自體軟骨缺損的臨床效果進行比較。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩種不同的軟骨移植方式在排斥率和感染率方面經(jīng)比較差異均無顯著性意義。但較之自體軟骨移植，異體軟骨移植存在明顯吸收現(xiàn)象。學(xué)者們還認(rèn)為，如果在臨床治療中利用良好的方法對異體軟骨予以妥善保存，則可顯著降低其移植后的吸收現(xiàn)象，達(dá)到與自體軟骨移植相同的治療效果。在采用組織工程人工骨進行軟骨修復(fù)治療時，基本要素是種子細(xì)胞和支架材料。構(gòu)建過程中，需要用到一定的種子細(xì)胞[28-29]。軟骨內(nèi)無血管、淋巴管和神經(jīng)，細(xì)胞被包埋在由軟骨基質(zhì)形成的軟骨囊內(nèi)，因此軟骨細(xì)胞具有抗原性弱，不易被機體免疫系統(tǒng)攻擊的特點，而且作為種子細(xì)胞，在獲取過程中經(jīng)過酶的消化、傳代培養(yǎng)及與生物材料的復(fù)合培養(yǎng)等系列處理，細(xì)胞表面抗原可被進一步消弱和包裹[30]。軟骨的這些免疫學(xué)優(yōu)勢使得同種異體軟骨細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞成為可能。 此次實驗過程中，選擇具備免疫力的乳兔體內(nèi)獲得軟骨細(xì)胞作為實驗所需的種子細(xì)胞。除種子細(xì)胞之外，在組織工程軟骨的構(gòu)建過程中，還需要使用相應(yīng)的支架材料。在軟骨組織工程生物材料研究中，人工合成和天然類等多種材料都被嘗試用于組織工程化軟骨組織構(gòu)建，以形成片狀和無中空結(jié)構(gòu)的簡單形態(tài)組織工程化軟骨為主，尚無適宜大塊中空形態(tài)軟骨組織構(gòu)建需求的生物材料，且普遍存在價格昂貴、加工工藝復(fù)雜等問題。因此，繼續(xù)探索理想的軟骨組織工程生物支架材料研究仍是面臨的課題。理想的支架材料應(yīng)該具有耐拉伸、生物相容性良好、無致炎性、無排斥性和易降解等特點，可為種子細(xì)胞提供所需的支撐。本次實驗過程中，選擇使用的支架材料為聚羥基乙酸。聚羥基乙酸具有良好的生物降解性和生物相容性，有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性、吸濕性，可作為支架材料，與軟骨細(xì)胞復(fù)合起來予以應(yīng)用[31-33]。將支架與軟骨細(xì)胞進行復(fù)合并進行軟骨缺損修復(fù)，植入動物體內(nèi)一段時間之后，支架材料會逐漸發(fā)生降解[34-35]。本次實驗過程中對聚羥基乙酸支架材料進行掃描電鏡觀察，可以觀察到聚羥基乙酸支架材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，說明聚羥基乙酸具有良好的空間結(jié)構(gòu)，可為軟骨細(xì)胞的附著和黏附等提供良好的條件[36]。實驗過程中，對標(biāo)本進行大體觀察可以發(fā)現(xiàn)，植入后4周，實驗組可以觀察到軟骨缺損得到一定的修復(fù)，修復(fù)區(qū)域未出現(xiàn)壞死，對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結(jié)締組織；植入后8周，實驗組軟骨缺損得到進一步修復(fù)，且修復(fù)界限不明顯，對照組軟骨缺損未得到修復(fù)，與周圍正常軟骨之間存在明顯的界限。結(jié)果顯示，使用同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸復(fù)合物對存在免疫力的乳兔進行喉甲狀軟骨缺損修復(fù)，可以獲得良好的軟骨修復(fù)效果。Ⅱ型膠原由軟骨細(xì)胞分泌，是軟骨的主要膠原成分之一[37-39]。Ⅱ型膠原的表達(dá)可反映出機體內(nèi)軟骨細(xì)胞的生長情況[40-51]。此次實驗中，實驗組細(xì)胞中富含豐富的Ⅱ型膠原，表明軟骨細(xì)胞大量增殖，顯著高于對照組(P < 0.05)，即提示，利用同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸復(fù)合物對存在免疫力的乳兔喉甲狀軟骨缺損進行修復(fù)，可獲得理想的治療效果。 作者貢獻(xiàn)：喬占清進行實驗設(shè)計，實驗實施為喬占清、張俊、馬賽、喬新明，實驗評估為喬占清、馬振亞，資料收集為司遠(yuǎn)征，喬占清成文，喬占清、喬新明審校。 利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。 倫理問題：實驗方案經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校*附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理部分審核并批準(zhǔn)，實驗過程中對動物的使用和處理方法及動物福利等問題均符合倫理要求。 文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進行3次查重。 文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。 作者聲明：文章*作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。 文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。 4 參考文獻(xiàn) References [1]孫安科,陳文弦,崔鵬程,等.同種異體工程化軟骨的構(gòu)建和修復(fù)甲狀軟骨缺損的實驗研究[J].中華耳鼻咽喉科雜志, 2001,36(4):278-280. [2]孫安科,陳文弦,崔鵬程,等.同種異體軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸復(fù)合物修復(fù)喉軟骨缺損[J].現(xiàn)代康復(fù), 2001,5(7): 43-44. [3]孫安科,孫靖,孫偉,等.無紡網(wǎng)與多孔海綿狀材料作為軟骨組織工程支架的適用性及體內(nèi)降解性[J].中國組織工程研究,2014,18(8):1172-1178. [4]孫安科,裴國獻(xiàn),周國平,等.改良以聚羥基乙酸為支架同種異體組織工程化塑形軟骨的構(gòu)建[J].*軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2002,22(11):996-999. [5]Bhavana K,Tyragi I,Ramani MK.Laryngotracheal reconstruction using iliac crest graft：an institutional experience.Indian J Otolaryngol Head Neck. 2010; 62(1):75-78. [6]楊大鑒,黃定強,胥方元,等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及聚羥基乙酸支架材料構(gòu)建人工軟骨的可行性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(14):2761-2764. [7]孫安科,裴國獻(xiàn),陳文弦,等.聚羥基乙酸負(fù)載軟骨細(xì)胞修復(fù)同種異體甲狀軟骨缺損[J].中華耳鼻咽喉科雜志, 2003, 38(5):347-350. [8]李軍政,成詩銀,崔鵬程,等.低溫凍存同種異體軟骨細(xì)胞在喉功能重建中的應(yīng)用[J].中國臨床康復(fù), 2005,9(2): 45-47. [9]李軍政.低溫凍存軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨及組織工程化軟骨的低溫凍存[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2005. [10]吳海濤,鐘翠平,王薇,等.軟骨細(xì)胞三維支架短期固定培養(yǎng)實驗研究[J].耳鼻咽喉頭頸外科,2000,7(5):298-301. [11]楊大鑒,黃定強,胥方元,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-支架復(fù)合體向軟骨誘導(dǎo)分化的實驗研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2005,28(5):394-396. [12]倪云峰,李小飛,劉源,等.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞混和培養(yǎng)體內(nèi)成軟骨[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008,12(16):3185-3188. [13]崔玉明,伍驥,胡蘊玉,等.聚乳酸/聚羥基乙酸復(fù)合骨形成蛋白修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國修復(fù)重建外科雜志, 2007,21(11):1233-1237. [14]Kim HKW,Moran ME,Salter RB.The potential for regeneration of articular cartilage in defects created by chondral shaving and subchondral abrasion.J Bone Joint Surg Am. 1991;73(9):1301-1315. [15]吳玉家,江華,周廣東,等.構(gòu)建帶內(nèi)支撐組織工程軟骨的實驗研究[J].中華整形外科雜志,2007,23(4):328-331. [16]孫安科,陳文弦,李東軍,等.聚羥基乙酸無紡網(wǎng)設(shè)計在軟骨組織工程中的適用研究[J].現(xiàn)代康復(fù),2001,5(6): 38-39. [17]李德保,田甜,章慶國等.膨體聚四氟乙烯(ePTFE)內(nèi)支撐組織工程軟骨的構(gòu)建實驗研究[J].中國美容醫(yī)學(xué), 2009, 18(6):823-826. [18]韓志軍,任華.兩種聚羥基乙酸支架與豬軟骨樣細(xì)胞體外相容性比較[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志,2011,2(1):42-45. [19]王永春,沈尊理,錢鋆,等.凍干骨和PLGA材料表面軟骨細(xì)胞增殖的形態(tài)學(xué)觀察比較[J].組織工程與重建外科雜志, 2007,3(1):19-21,51. [20]崔玉明,伍驥,胡蘊玉,等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性軟骨細(xì)胞復(fù)合聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009,13(51):10049- 10054. [21]李紅喜,張睿,李華哲,等.軟骨細(xì)胞聯(lián)合BMP/bFGF移植對關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2013, 13(22):4237-4241. [22]Kiss A,Cucchiarini M,Menger MD,et al.Enamel matrix derivative inhibits proteoglycan production and articular cartilage repair, delays the restoration of the subchondral bone and induces changes of the synovial membrane in a lapine osteochondral defect model in vivo.J Tissue Eng Regen M.2014;8(1):41-49. [23]Lohmann CH,Schwartz Z,Niederauer GG,et al. Pretreatment with plaet derived growth factor-BB modulates the ability of costochondral resting zone chondrocytes incorporated into PLA/PGA scaffolds to form new cartilage in vivo.Biomaterials. 2000;21(1):49-61. [24]Lim SY,Mun GH,Hyon WS,et al.The elevation of the constructed auricle with a temporoparietal fascial flap wrapping a resorbable plate.J Plast Reconstr Aesthet surg.2006;59(5):505-509. [25]Homicz MR,Chia SH,Schumacher BL,et al.Human septal chondrocyte redifferentiation in alginate, polyglycolic acid scaffold, and monolayer culture. Laryngoscope.2003;113(1):25-32. [26]鄭信民,董淑芬,胡永聲,等.人同種軟骨移植的臨床及實驗室觀察[J].中華整形燒傷外科雜志,1990,37(2):91-93. [27]Donald PJ.Cartilage grafting in facial reconstruction with special consideration of irradiated grafts. Laryngoscope.1986;96(7):786-807. [28]夏萬堯,劉偉,劉天一,等.應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程化管狀軟骨的實驗研究[J].中華顯微外科雜志, 2005,28(4):328-330,插圖4-4. [29]苗春雷,周廣東,劉天一,等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨的初步研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2004,24(4):246-249,283. [30]孫晉客,劉鋒,范衛(wèi)民,等.不同材料包埋的PGA支架對軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J].江蘇醫(yī)藥, 2006,32(7): 642-644, 插4. [31]歐陽彬,范衛(wèi)民,馬益民,等.殼聚糖、Ⅱ型膠原和PGA三種支架體外構(gòu)建組織工程軟骨的比較研究[J].江蘇醫(yī)藥, 2007,33(9):904-906 [32]倪云峰,李小飛,劉源,等.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)成軟骨的實驗觀察[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2006,27(7):612-614. [33]Jiang J,Zhao Z,Guoyu L,et al.Syntheses and evaluation of copolymer 6-aminohexanoic acid and 4R-hydroxy-L-proline for bone repair//Materials Engineering and Automatic Control.2012:491-496. [34]Poologasundarampillai G,Ionescu C,Tsigkou O,et al.Synthesis of bioactive class II poly(γ-glutamic acid)/silica hybrids for bone regeneration.J Mater Chem.2010;20(40):8952-8961. [35]Thomson RC,Yaszemski MJ,Powers JM et al. Hydroxyapatite fiber reinforced poly(alpha-hydroxy ester) foams for bone regeneration.Biomaterials. 1998;19(21):1935-1943. [36]I.Raizer,W.Chrzanowski,W.Binias et al.Nano Hydroxyapatie Polylactic Acid Electrospun Scaffolds for Bone Tissue Engineering[C].//23rd European conference on biomaterials 2010.2010:449-449. [37]Hollinger JO,Mayer M,Buck D.Poly(α-hydroxy acid) carrier for deliverking recombinant human bone morphogenetic protein-2 for bone regeneration.J Controll Release.1996;39(39):287. [38]Fukuda A,Kato K,Hasegawa M,et al.Enhanced repair of large osteochondral defects using a combination of artificial cartilage and basic fibroblast growth factor. Biomaterials.2005;26(20):4301-4308. [39]Tang C,Xu Y,Jin C,et al.Feasibility of Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Matrix Scaffold for Cartilage Tissue Engineering. Artificial Organs.2013;37(12):E179-E190. [40]崔玉明,伍驥,胡蘊玉,等.聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物修復(fù)髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011,15(16):2877-2880. [41]Lee CC,Lo Y,Ho LJ,et al.A New Application of Parallel Synthesis Strategy for Discovery of Amide-Linked Small Molecules as Potent Chondroprotective Agents in TNF-α-Stimulated Chondrocytes.PLoS One. 2016; 11(3):e0149317. [42]Anbarasan S,Baraneedharan U,Paul SF,et al.Low dose short duration pulsed electromagnetic field effects on cultured human chondrocytes: An experimental study.Indian J Orthop.2016;50(1):87-93. [43]Mueller M,Weinmann D,Toegel S,et al.Compounds from Caesalpinia sappan with anti-inflammatory properties in macrophages and chondrocytes.Food Funct. 2016;7(3):1671-1679. [44]Dai X,Li Y,Zhang R,et al.Effects of sodium selenite on c-Jun N-terminal kinase signalling pathway induced by oxidative stress in human chondrocytes and c-Jun N-terminal kinase expression in patients with Kashin-Beck disease, an endemic osteoarthritis.Br J Nutr.2016:1-9. [Epub ahead of print] [45]Huang Z,Du S,Huang L,et al.Leptin promotes apoptosis and inhibits autophagy of chondrocytes through upregulating Lysyl oxidase-like 3 during osteoarthritis pathogenesis.Osteoarthritis Cartilage. 2016.pii: S1063-4584(16)01042-6. [46]Recha-Sancho L,Semino CE.Heparin based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.J Biomed Mater Res A.2016.doi: 10.1002/jbm.a.35699. [Epub ahead of print] [47]Huang Z,Li J,Du S,et al.Effects of UCP4 on the Proliferation and Apoptosis of Chondrocytes: Its Possible Involvement and Regulation in Osteoarthritis. PLoS One.2016;11(3):e0150684. [48]48 Yoon HI,Yhee JY,Na JH,et al.Bioorthogonal Copper Free Click Chemistry for Labeling and Tracking of Chondrocytes In Vivo.Bioconjug Chem. 2016. [Epub ahead of print] [49]Cizelj I,Dušani? D,Ben?ina D,et al.Mycoplasma and host interaction: In vitro gene expression modulation in Mycoplasma synoviae and infected chicken chondrocytes. Acta Vet Hung.2016;64(1):26-37. [50]Yeh HY,Hsieh FY,Hsu SH.Self-patterning of adipose-derived mesenchymal stem cells and chondrocytes cocultured on hyaluronan-grafted chitosan surface.Biointerphases. 2016 5;11(1):011011. [51]Xu HG,Ma MM,Zheng Q,et al.P120-Catenin Protects Endplate Chondrocytes from Intermittent Cyclic Mechanical Tension Induced Degeneration by Inhibiting the Expression of RhoA/ROCK-1 Signaling Pathway.Spine (Phila Pa 1976).2016.[Epub ahead of print]